浅论丹参提取液对HMGB1胞外释放的抑制作用

浅论丹参提取液对HMGB1胞外释放的抑制作用【摘要】目的：研究丹参对内毒素脂多糖激活后巨噬细胞高迁移率族蛋白B1释放和内毒素血症小鼠血清HMGB1水平的影响。方法：使用不同浓度的丹参提取液处理100ng/mlLPS激活的培养巨噬细胞株RAW，观察培养上清液中HMGB1水平和细胞HMGB1mRNA表达的变化，并通过腹腔内注射LPS建立的内毒素血症小鼠模型，观察丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平和存活率的影响。细胞培养上清液和血清HMGB1含量采用酶联免疫分析方法检测，细胞HMGB1mRNA表达采用RTPCR方法检测。结果：丹参提取液明显抑制LPS激活后的巨噬细胞HMGB1释放和HMGB1mRNA表达，降低内毒素血症小鼠血清HMGB1水平并提高存活率。结论：丹参有抑制巨噬细胞HMGB1释放和保护内毒素血症小鼠的作用。

【关键词】丹参；高迁移率族蛋白B1；巨噬细胞；内毒素血症

［Abstract］Objective:TostudytheeffectsofSalviamiltiorrhizaonthereleaseofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)fromendotoxinstimulatedmacrophagesandserumHMGB1levelofendotoxemiamice.Methods：HMGB1concentrationintheculturemediumandexpressionofHMGB1mRNAwereanalysedbyenzymelinkedimmunosorbentassayandRTPCR,respectively,after100ng/mllipopolysaccharide(LPS)stimulatedmacrophagelikeRAWcellsweretreatedwithdifferentdosesofSalviamiltiorrhizaextract.Inaddition,theeffectofSalviamiltiorrhizaextractwasinvestigatedonserumHMGB1levelandsurvivalrateofendotoxemiamicewhichwereestablishedbyintraperitonealinjectionofLPS.Results：SalviamiltiorrhizaextractmarkedlysuppressedthereleaseofHMGB1andexpressionofHMGB1mRNAinLPSstimulatedmacrophages,anddecreasedserumHMGB1levelofendotoxemiamicewiththesurvivalrateelevated.Conclusion：SalviamiltiorrhizasuppressedextracellularreleaseofHMGB1inendotoxinstimulatedmacrophages,andconferredprotectionagainstendotoxinlethality.

［Keywords］Salviamiltiorrhiza;highmobilitygroupbox1;macrophages;endotoxemia

胞外高迁移率族蛋白B1为近年发现的一种晚期炎症介质，在脓毒症、关节炎、肺炎、急性胰腺炎等疾病的发病机制中起着十分重要的作用［1-4］。鉴于HMGB1在诸多炎症性疾病病理中的重要性，HMGB1靶向治疗研究已引起广泛重视［3,4］。丹参(Salviamiltiorrhiza)为唇形科鼠尾草属植物的干燥根及根茎，具有活血通经、凉血消肿、祛痈肿丹毒之功效［5,6］。我们在筛选中药抗HMGB1成分研究中发现丹参提取液具有明显抑制巨噬细胞HMGB1释放和保护内毒素血症小鼠的作用，现报告如下。

1材料与方法

实验材料

BALB/c小鼠由江苏省血吸虫病防治研究所提供；丹参购自甘肃天水药材供应站(经无锡市人民医院许英华主任药师鉴定)；巨噬细胞株RAW购自中国科学院细胞库。内毒素脂多糖为Sigma公司产品，mRNA提取试剂盒为Promega公司产品，MMLV一步法RTPCR试剂盒为上海捷瑞公司产品。

方法

丹参提取液的制备

丹参经纯水漂洗后，水煎2次，合并2次水煎液，μm过滤器过滤并调整浓度至1g/ml(按生药计算)。

HMGB1浓度测定

采用酶联免疫分析方法。小鼠HMGB1ELISA试剂盒为武汉中美科技有限公司产品，按产品使用说明书进行。

HMGB1mRNA表达检测

应用mRNA提取试剂盒，在细胞培养皿中直接裂解细胞mRNA。HMGB1引物：5′ATGGGCAAAGGAGATCCTA3′，5′ATTCATCATCATCATCTTCT3′。以三磷酸甘油醛脱氢酶作为内参对照，引物：5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′，5′AGATCCACAACGGATACATT3′。HMGB1mRNA表达水平以HMGB1与GADPH基因扩增条带光密度比值表示。

培养细胞实验

巨噬细胞株RAW使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃，5%CO2培养箱中进行培养，隔天传代1次。细胞贴壁覆盖80%～90%时进行实验。以LPS组和丹参处理组各25只，后者于注射LPS后0，24，48，72h以15g/kg剂量给小鼠腹腔内注射丹参提取液，观察小鼠存活情况。

统计学方法

采用SPSS统计软件包进行双侧t检验分析和χ2检验分析，为差异有统计学意义。

2结果

丹参提取液对巨噬细胞HMGB1释放的作用

丹参提取液明显抑制LPS激活后巨噬细胞株RAWHMGB1的释放，并呈剂量相关性，见表1。表1丹参提取液对巨噬细胞株RAW培养上清液中HMGB1水平的影响，Tab1EffectofSalviamiltiorrhizaextractonHMGB1levelintheculturemediumofmacrophagelikeRAWcells。

丹参提取液对巨噬细胞HMGB1mRNA表达的影响

巨噬细胞株RAW受LPS激活20h后HMGB1mRNA表达显着升高，而丹参提取液对其表达具有明显抑制作用,见图1。

丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平和存活率的影响

丹参提取液对内毒素血症小鼠有明显的保护作用，96h后小鼠存活率由32%提高至64%,见图2。同时，丹参提取液明显降低了内毒素血症小鼠血清HMGB1水平,见表2。表2丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平的影响,Tab2EffectofSalviamiltiorrhizaextractonserumHMGB1levelofendotoxemiamice

3讨论

高迁移率族蛋白因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名，包括HMGA，HMGB，HMGN3个家族,而HMGB家族有3个成员即HMGB1，HMGB2，HMGB3。HMGB1作为核内一种典型的非组蛋白,长期以来的研究主要集中在其核内功能，包括参与核小体的构建和稳定，调节基因的转录、参与DNA的重组修复和复制等。1999年，Wang等［7］发现HMGB1可通过活化细胞的主动分泌释放到胞外并介导炎症反应，为内毒素血症和脓毒症的重要炎症介质，随后胞外HMGB1的致炎作用引起广泛兴趣和重视。近年来的研究［1-4］证实,胞外HMGB1为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子，参与多种疾病如脓毒症、关节炎、急性胰腺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、脑膜炎、肾脏疾病、心血管疾病等的发病过程。目前，HMGB1靶向治疗研究已引起人们关注，而HMGB1靶向治疗的关键是研发有效的HMGB1拮抗剂。

目前已发现有HMGB1拮抗作用的有抗HMGB1抗体、HMGB1Abox蛋白和丙酮酸乙酯等［4,7］。中国使用中药历史悠久、资源丰富，中药对许多疾病具有明显的疗效，世界各国对中药的研究和应用也日趋重视,但对中药及其有效成分的抗HMGB1作用研究甚少。本课题组在严重急性呼吸综合征暴发期间，曾对国内治疗SARS的几种主要中药配方进行抗HMGB1作用的实验研究，发现这些中药配方具有明显抑制巨噬细胞株RAW和人外周血单核细胞的HMGB1释放作用，并提出HMGB1参与SARS的发病机制［8］。最近，Chen等［9］和Li等［10］研究发现绿茶提取物和绿茶主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有抑制HMGB1释放的作用，后者可明显提高脓毒症小鼠的存活率。

丹参是最常用的活血化瘀中药之一，在《神农本草经》中被列为上品，现代药理研究发现丹参具有保护心脏缺血缺氧、改善微循环、抑制血小板聚集和血栓形成、中枢镇静、抗氧化、抗菌消炎及增强免疫功能等作用［5］。本研究显示，丹参提取液对内毒素致巨噬细胞HMGB1释放具有明显的抑制作用，其作用机制与抑制细胞HMGB1基因表达有关，但其信号转导过程值得进一步研究。动物实验结果显示，丹参提取液能明显降低内毒素血症小鼠血清HMGB1水平，同时能提高内毒素血症小鼠的存活率。鉴于胞外HMGB1为内毒素血症致死的重要炎症介质，丹参提取液可能通过抑制细胞HMGB1释放、降低血清HMGB1水平而阻止内毒素血症的发展和恶化。徐鑫荣等［11］报道，丹参注射液能改善内毒素休克兔的心、肝、肺功能，减轻全身炎症反应及部分脏器病理损害，丹参注射液对内毒素休克多器官损伤的保护作用可能与丹参抑制HMGB1释放有关。我们下一步将对丹参抗HMGB1作用的有效成分进行研究。

【参考文献】

［1］KluneJR,DhuparR,CardinalJ,etal.HMGB1:endogenousdangersignaling［J］.MolMed,2008,14(7-8):476-484.

［2］KarlssonS,PettilV,TenhunenJ,etal.HMGB1asapredictoroforgandysfunctionandoutcomeinpatientswithseveresepsis［J］.IntensiveCareMed,2008,34(6):1046-1053.

［3］WangH,ZhuS,ZhouR,etal.TherapeuticpotentialofHMGB1targetingagentsinsepsis［J］.ExpertRevMolMed,008,4(10):e32.

［4］YangH,OchaniM,LiJ,etal.Reversingestablishedsepsiswithantagonistsofendogenoushighmobilitygroupbox1［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(1):296-301.

［5］刘艾林,李铭源,王一涛,等.丹参药理学活性物质基础研究现状［J］.中国药学杂志,2007,42(9):641-646.

［6］吴建农,张建新,刘敏,等.丹参对急性坏死性胰腺炎肾脏损害的干预作用［J］.江苏大学学报：医学版,2004,14(6):500-504.

［7］WangH,BloomO,ZhangM,etal.HMG1asalatemediatorofendotoxinlethalityinmice［J］.Science,1999,285:248-251.

［8］ChenG,ChenDZ,LiJ,etal.PathogenicroleofHMGB1inSARS?［J］.MedHypotheses,2004,63:691-695.

［9］ChenX,LiW,WangH.Moreteaforsepticpatients—Greenteamayreduceendotoxininducedreleaseofhighmobilitygroupbox1andotherproinflammato