答辩问题总结分发稿

基础问题；实验问题；实验设计问题;本文的贡献创新点PCA和PLS-DA,PLS=DA为什么要做过拟合检验如果建立模型时使用的主成分数过少，就不能反映未知样品被测组分产生的光谱数据变化，其模型预测准确度就会降低，这种情况称之为不充分拟合。如果使用过多的主成分建立模型，就会将一些代表噪音的主成分加到模型中，使模型的预测能力下降，这种情况称之为过度拟合。采用交互验证的方法检验模型的内部稳健性和拟合效果查一下文献说明核磁不仅可以应用与纯物质的结构解析，也可以应用于混合物的分析。（有人质疑核磁方法找到标记物的实用性）核磁方法用于代谢组学的历史以及广泛应用的程度。英国尼克森最早使用核磁共振的方法做代谢组学研究美国科学家最早做采用液质联用的方法进行代谢组学研究代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学性质差异很大，要对他们进行无偏向性的全面分析，单一的奋力分析手段难以胜任。核磁方法对含氢化合物的具有普适性的特点，1H因具有非常高的丰度和良好的共振特征而应用最广泛。图中的峰与化合物中的氢一一对应，信号的强弱还可以定量分析。但是对于大多数生物有机物，要想阐明其完整的结构信息，仅仅依靠一维核磁谱图是不够的，还应该应用同核二维和异核二维谱来解析结构，异核二维谱对未知物的鉴定极为重要。目前还是主要依据操作者的经验和熟练程度，代谢物的鉴定是代谢组学发展的瓶颈。有待于进一步完善。核磁分析法中标记物的鉴定过程，举例子。通过与标准品德谱图进行对比，文献参考，在线数据库检索。根据峰裂分情况并结合特征化学位移，比对特征峰位，峰形，确定峰归属。例如在线数据库检索到3-羟基丁酸在化学位移1.20的位置有一个双峰，丙氨酸在化学位移1.47处有一个双峰，从本实验得到放大的氢谱中可以看出化学位移1.16和1.48处均有双峰，所以推断该化学位移处是3-羟基丁酸和丙氨酸。液质联用法方法学考察的具体方法，简述方法学考察的优缺点(选取离子法和主成分分析法)。方法学考察的方法以及QC样品有什么要求，提取离子的选择原则是什么：提取离子保留时间和峰面积的RSD和RE值；PCA分析(对总离子流色谱图全谱进行的处理)混合样品，保留时间，峰面积，分离情况，标志物和非标志物如何寻找生物标记物，鉴定的依据是什么，方法是否可靠，生物标志物峰的指认Loading中散在外面的点可能是标记物，通过统计分析Ttest确定有显著性差异的化合物才是生物标志物。代谢物的鉴定是通过分析一、二级质谱信息、在线检索一些数据库，如HMDB(www.hmdb.ca)>METLIN()>MassBank(http://www.massbank.jp)和KEGG(http://www.kegg.jp)等，及与对照品比对而鉴定的。提取该离子的提取离子色谱峰应是一个具有成型且分离度良好的色谱峰。核磁方法学的问1HNMR是最早应用于代谢组学研究的分析方法，样品前处理，数据采集参数已经成熟，应用广泛，故未对其进行方法学考察。如果做方法学的话应该包括实验温度，缓冲液的浓度，预饱和功率，加内标和外标的方法。核磁方法中样品与处理中磷酸缓冲盐的作用是什么？TSP的全称和作用是什么？磷酸盐缓冲液的作用是维持稳定的pH值，防止pH对样品中具有离子化基团的分子的化学位移产生影响(-NH2,-COOH)。重水的作用：锁场。TSP:定标化合物，因为该化合物在核磁分析中化学位移是0。3-三甲基硅基丙酸钠TMSDSS核磁共振法分析过程：调谐-匀场，锁场-选择脉冲序列-设置参数-采样数据预处理：去噪，溶剂峰消除，相位校正，基线校正，分段积分，归一化，标准化。血-CPMG：消除蛋白质类大分子物质的干扰尿-NOESY：压制水峰液质联用的峰匹配，峰对齐、归一化是怎么做的？用Masslnyx软件处理的，在Editmethod项下操作，最重要的是设定保留时间和质荷比的偏差范围，eg±0.5.生物标志物水平的变化是依据什么液质联用法是根据相对峰面积的强度，核磁法是依据积分得到的面积。看一个变量的水平在不同组别大鼠中的变化趋势。代谢组学内标的选择代谢组学分析的是生物样品的全谱°UPLC-MS法找一个合适的内标是很困难的，因此一般不选内标，采用总面积归一化。GC-FID一般选择烷酸类比如十七烷酸做内标，数据处理米用内标归一化法（标志物峰面积除上内标的峰面积）。核磁法选TSP做内标，化学位移是零。如果做定量分析则一定要选择内标，比如做溶血磷酯酰胆碱类的定量分析，则要选择体内不含有的胆碱类作为内标。内标的选择和使用将严重影响定量的准确性。模型的选择以及模型建立成功的考量标准，大鼠的分组，空白对照法，还是自身对照法（消除个体差异，适合造模时间短的模型，）给药剂量的选择，怎么没有做剂量依赖性？阳性对照药材选择原则，为什么本实验没有采用阳性对照药材。阳性对照组通常是将模型动物给予一定的确实有效的药物加以处理，看看其治疗效果如何？阳性对照药的目的，就是看在此模型状态下，药物是否对之有效？假如阳性对照药都没有效的话，那可能此模型或者给药方式有问题；而阳性对照药有效，被测试的药物没有效，则说明被测药物不行。另一方面，被测药物与阳性药物对照，可看出孰优孰劣。因此，经此对比，可以突出被测药物的作用。但，并不是每一个实验都能找到阳性对照药，也不是每一个实验都需要设置阳性对照组。阳性药物对照试验是将受试药物与已知的活性有效药物进行对照的临床试验，根据试验的目的常分为优效性试验和非劣效性或等效性试验两种。试验设计的关键，是通过阳性药物对照来证明受试药和对照药之间的差别（优效性），或证明两药之间的非劣效性或等效性。一般而言，为观察受试药物作用是否存在、为比较两种药物疗效和安全性的临床试验中，通常采用阳性药物进行对照。阳性对照药物必须能被试验所在区域接受，必须是在相关专业领域内得到学术界公认的、对所研究的适应症疗效最为肯定并且是最安全的药物，特别是在最近药典中收载的药物。原则上应选择与受试药有相同结构、相同药理作用、相同作用机制、相同剂型、相同给药途径的已在国内上市的同一类药物。补充对照品和对照药材：首先要明白做定性鉴别的目的，是为了防止伪劣药材，如果一个药材里面含有一个化合物成分，比如说黄连含小檗碱，我们以小檗碱作为对照品，如果我们仅仅以小檗碱做对照品进行定性鉴别，那么有一个情况不得不考虑，用一些特殊手段在伪劣的黄连药材中加入小檗碱，你做薄层鉴别黄连是合格的，甚至你用hplc做含量都是合格的。但是用对照药材就可以清晰的辨别出黄连的伪劣。（一个对照品就一个斑点，而对照药材是鉴定过的药材，有很多斑点。比如说黄连和黄柏含小檗碱所以用小檗碱作为对照品是不够的）钙滴定方法的确定钙测定法采用原子吸收光谱法和EDTA络合滴定法，查了一些文献，由于有些试剂难以买到，比如氤化钾，而不能重现，因此我们参考熊志立和王大为论文中的方法做的。钙指示剂的配置方法，文献报道有三种，0.15%的丙酮-水（1:1）溶液，0.5%的乙醇溶液，钙羧酸指示剂-NaCl固体（1:50）研匀，固体指示剂稳定且终点敏锐。指示剂用量少许即可。滴定剂的浓度和用量问题。EDTA经氧化锌（ZnO标定）磷测定方法的确定以及细节问紫外-可见分光光度法的选择：查阅文献后得知，文献中有采用微波消解法和酸碱滴定法，我们对微波消解法不是很熟悉，酸碱滴定法引入多种酸碱指示剂，若终点判断有误差和滴定体积有误差，会引入很大的误差。所以我们采用2005版药典中的方法测定骨中的有机磷的含量。紫外-可见分光光光度法条件摸索：显色剂的种类，用量，显色时间，波长选择等。因为采用的是药典的方法因此没有经过条件摸索。显色剂的用量，应该是定量过量的，对待测物来说是定量过量的。本实验没有考察显色剂用量，而是将骨溶液的浓度控制在线性范围内，直接使用原来的显色剂量。紫外-可见分光光光度法方法学考察：试剂空白：用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样的方法处理。含量测定方法的采用：标准曲线法。做出的标准曲线，如果截距足够小就可以用外标一点法。将标准曲线的最低点代入标准曲线方程，如果ax项是b项的20倍，则可以采用外标一点法。若果截距不够小，则将测得值带入标准曲线计算。但是样品一天测不完，则需每天随行一条标准曲线。肾组织样品预处理方法的问方法的摸索：梯度洗脱程序，提取方法（匀浆，液液萃取），提取试剂（氯仿-甲醇不同比例，乙酸乙酯）蛋白质浓度的测定原理及方法总结蛋白质溶液浓度测定方法有多种，一、双缩脲法双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，全令仍广泛采用.在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。一、 双缩月尿法双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，全令仍广泛采用.在需要快速,但不很准确的测定中，常用此法.硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的.双缩尿法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收.双缩尿法常用于0.5g/L〜10g/L含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定.二、 Lowry法此法是双缩尿法的进一步发展.他的第一步就是双缩尿反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物,然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物.此法比双缩尿法灵敏得多，适合于测定20mg/L〜400mg/L含量的蛋白质溶液.其干扰物质与双缩尿法相同，而且受他们的影响更大,硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差.另外要注意的是,加入福林试剂时要特别小心,试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生,因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时,必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原.三、 紫外吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,因此,利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量.如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1〜0.5mg/ml含量的蛋白质溶液.部分纯化的蛋白质常含有核酸,核酸在260nm波长处有最大吸收.有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正,一般按下述公式粗略计算：是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值.是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值.此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的.因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用.由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同,因此,浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5〜2.5之间变化.所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收.例如，牛血清白蛋白的a0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7,而在280nm处测为0.58.在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的.从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10pl/ml〜100pl/ml的蛋白质.蛋白质浓度可以近似地由下式得到： 光密度之差求得,这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差.但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正.由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致.流动相添加剂的作用：甲酸和醋酸铵是较多采用的流动相添加剂。流动相添加剂可以使得峰形变好，改善离子响应。方法学考察时是否需要考虑基质效应和提取回收率？（一） 用于评价样品和内标等的回收程度，一般用绝对响应（峰面积或峰高）直结计算，与方法的灵敏度很相关。绝对回收率：考察测定结果与“真值”的接近程度，从生物样本基质中回收得到目标物质的响应值除以纯标准品产生的响应值即为分析物的绝对回收率。应选用高、中、低三种浓度分别进行考察，绝对回收率一般要求在50%〜80%（这个数值范围书上是这么写的，不过，个人认为接近100%更好，太低的话，比如说20%等，可能方法就不容易建立，此时，应更投提取体系，或者是采用反提法等）。提取回收率：空白基质中定量加入药物，经处理后与空白基质处理后加入相同量药物的比值。绝对回收率与提取回收率的关系：绝对回收率=提取回收率/（1-基质效应）对于液相色谱等而言，基质效应为0，此时，绝对回收率等于提取回收率。（二） 用于评价方法的准确度，等同于相对偏差的作用，用测定所得浓度结果去计算。相对回收率（又称方法回收率），从生物样本基质中回收得到目标物质的响应值除以加入到生物基质中已知量的标准品产生的响应值即为分析物的相对回收率。该评价指标已扣除了目标药物在样品的前处理过程损失而造成的系统误差。高、中浓度点测得的相对回收率应在85〜115%，低浓度(定量限)应在80〜120%。代谢组学检测的是生物体液中的内源性代谢物，如何避免基质效应？尽量优化条件，是色谱峰达到基线分离。UPLC-MS的高分辨率可以有效地减少离子抑制。基质效应的含义是简单说就是“样品中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响”，这个在LC-MS的检测中比较常见，因为基质会影响到被分析物的电离程度，从而影响响应值，仅为参考化学分析中，基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。例如，溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应(matrixeffect)。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线(calibrationcurve)。固体样品同样有很强的基质效应，对其校正也尤为重要。对于复杂的或者未知组分基质的影响，可以采用标准添加法(standardadditionmethod)。在这一方法中，需要测量和记录样品的响应值。进一步加入少量的标准溶液，再次记录样品的响应值。理想地说来，标准添加应该增加分析物的浓度1.5到3倍，同时几次添加的溶液也应该保持一致。使用的标准样品的体积应该尽可能小，尽量降低过程中对基质的影响。为什么每个疾病找到的都是类似的标记物，相似的代谢途径，阐述原因代谢组学适用于哪些疾病的研究代谢组学的研究方法具体步骤，以及各步骤的重要性。样品的采集，样品的预处理，代谢组学数据的采集，数据处理方法，标志物鉴定和生物学解释。样品的采集要求具有一定的代表性和统计学意义，以减少个体差异对分析结果的影响。在样品的采集和保存过程中要避免由于残留酶活性或者细菌引起的影响。代谢组学力求分析生物体系中的所有代谢产物，所以整个过程中都强调尽可能的保留和反映总的代谢产物的信息。代谢组学常用的生物样品预处理方法主要有沉淀蛋白、液液萃取、固相萃取和稀释等。样品的预处理应确保待分析样品的成分稳定，重现性高。不同的分析技术平台要求样品的预处理方法也不相同，例如基于色谱技术的平台一般要对样品进行除蛋白、浓缩或稀释等处理；采用气相色谱方法进行分析时还需对样品进行衍生化处理，而采用核磁共振技术平台，只需用缓冲盐对样品进行简单的稀释处理。数据的采集样品预处理之后，其中的代谢物需要采用不同的分析方法测定。目前核磁代谢组学分析样本中不同样本的特点血液涵盖的信息量较大，内源性代谢物成分比较稳定；尿液不具有侵入性且经过肾小球滤过使代谢物的到浓缩。UPLC-MS和HNMR以及GC-FID不同分析方法的优缺点，如何相互补充NMR核磁共振技术是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的分析技术。其优点为：（1）样品预处理方法简单；（2）不会破坏样品的结构和性质，具有无破坏性；（3）可在接近生理条件下进行实验，可在一定温度和缓冲液范围内选择实验条件；（4）无偏向性；（5）1HNMR的谱峰与样品中各化合物的氢原子一一对应，图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量。因此，NMR适合研究代谢物中的复杂组分，是最早应用于代谢组学研究也是目前应用较广泛的分析技术［3,9-11］。LC/MS液相色谱（LC）具有分离效率高、分析速度快、应用范围广等特点。当其与质谱（MS）联用时，能够集LC的高分离性能和MS的高灵敏度、高专属性等优点于一体。尤其是近年来超高效液相色谱/质谱（UPLC/MS）技术的广泛应用使复杂组分能更好的分离和检测。与GC/MS技术相比，LC/MS避免了衍生化等繁杂的预处理过程，广泛地应用于难挥发性、极性和热不稳定化合物的定性和定量分析。目前，LC/MS技术已发展成为代谢组学研究的主流技术手段。GC/MS气相色谱作为一种成熟的分析技术可连接多种检测器，在代谢组学研究中以火焰离子化检测器（FID）和质谱检测器最为常见。GC/MS技术可以通过标准谱库提供化合物的结构信息且具有高灵敏度等优势，因而非常适合于代谢组学的研究［15-17］。骨碎补■预肾阳虚症的依据，对于骨疏和肾虚的关系。标记物解释，与尿的相关性，与肾阳虚的相关性骨质疏松症模型如何应用到人药效物质组学其他补肾壮骨复方中药材都有哪些淫羊藿，骨碎补，蛇床子，数据处理方法之间的比较以及参数的范围和意义PCA和PLS-DA是代谢组学研究中应用最广泛的模式识别方法。PCA不需要样本分类的任何背景信息，在保持数据信息损失最少的原则下，对高维变量进行降维处理的线性映射方法。PLS-DA是在已知样本分类信息的情况下，建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大分离，再利用所建立的多参数模型对未知样本进行预测。对于PCA和PLS-DA，均使用得分图(scoreplot)表征样本间的区别和相似程度，使用载荷图(loadingplot)表征对样本间区别或相似性有重要贡献的变量，找出