兽医实验室人员培训内容

培训内容分为三部分:一、血凝及血凝抑制试验实验操作为高致病性禽流感抗原及抗体测定二、间接血凝试验试验讲解为口蹄疫抗体测定三、ELISA试验谢谢阅读谢谢阅读利用特异性抗体或病毒血凝素与红细胞表面相应抗原结合而出现凝感谢阅读集现象，用于检测特异性抗体或病毒血凝素。红细胞凝集试验血凝和血凝抑制试验某些病毒或病毒的血凝精品文档放心下载素,能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集,这种凝集红细谢谢阅读胞的现象称为血凝（hemagglutination，HA),也称直接血凝反应,谢谢阅读当病毒的悬液中先加入特异性抗体,且这种抗体的量足以抑制病毒颗精品文档放心下载精品文档放心下载接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制精品文档放心下载(hemagglutinationinhibiion,HI)反应，也称血凝抑制反应.精品文档放心下载血凝抑制(HI）试验禽流感流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白,具有识别并吸附于红细感谢阅读胞表面受体的结构，试验由此得名。蛋白的抗体与受体的特谢谢阅读异性结合能够干扰蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。精品文档放心下载该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。谢谢阅读可用于流感病毒分离株精品文档放心下载有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体.HA—HI试验的优点是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用感谢阅读感谢阅读亚型相一致精品文档放心下载时才能出现感谢阅读细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异感谢阅读凝集素，对于其它禽种,也可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞；感谢阅读需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。精品文档放心下载1阿氏（Alsevers称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠。8g、柠檬酸0。、氯化谢谢阅读钠0.42g，加蒸馏水至100mL,散热溶解后调pH值至感谢阅读15min高压灭菌，4℃保存备用。2鸡红细胞液的制备1采血用注射器吸取阿氏液约2只SPF谢谢阅读果没有SPF精品文档放心下载采血约10mL阿氏液的离心管中混精品文档放心下载匀。2。2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500~1800r/min谢谢阅读离心8～谢谢阅读1800r/min离心8分钟,用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细精品文档放心下载胞薄膜,再重复2次以上过程后，加入阿氏液20感谢阅读胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞,谢谢阅读在锥形刻度离心管中离心1500～1800r/min8分钟，弃去上清液,精品文档放心下载准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL),加入9谢谢阅读盐水,用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。41%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1，精品文档放心下载加入9mL生理盐水，混合均匀即可。3抗原血凝效价测定（试验，微量法)3.1在微量反应板的1孔～孔均加入。025mLPBS，换滴感谢阅读头。3。2吸取0。025mL病毒悬液加入第l孔，混匀。精品文档放心下载3.3从第1孔吸取病毒液加入第20。感谢阅读025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第孔，从第孔吸取谢谢阅读。025mL弃之，换滴头。3。4每孔再加入0.025mLPBS。3.5每孔均加入0.025mL体积分数为％鸡红细胞悬液（将鸡精品文档放心下载。6振荡混匀，在室温（～25℃）下静置40min后观察结精品文档放心下载果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1感谢阅读胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3。7结果判定感谢阅读表：血凝试验结果判读标准孔底所见1红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集++++感谢阅读2红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈+++3红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块+4红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块—5感谢阅读凝集精品文档放心下载该抗原的血凝效价,此效价为1精品文档放心下载4血凝抑制（HI）试验（微量法)1根据3的试验结果配制4HAU谢谢阅读病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的精品文档放心下载4HAU抗感谢阅读原的稀释倍数应是：64（除以4.2在微量反应板的1孔～孔加入0.025mL第孔加谢谢阅读入0.05mLPBS。3吸取0.025mL血清加入第1孔内,充分混匀后吸0.025mL谢谢阅读于第2孔，依次对倍稀释至第10孔从第孔吸取0.025mL弃去。谢谢阅读41孔~11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液，感谢阅读室温（约20℃）静置至少30min.5每孔加入体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀,感谢阅读轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃精品文档放心下载.4.6结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为滴度。感谢阅读只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差感谢阅读不超过1个滴度,试验结果才有效。价小于或等于21og2判定精品文档放心下载试验阴性；价等于31og2为可疑，需重复试验；价大于或等谢谢阅读于为阳性。正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载谢谢阅读体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，在有电谢谢阅读解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应.正向间接血凝谢谢阅读谢谢阅读简单,实验原理也易于理解，在基层实验条件和技术相对落后的情况感谢阅读下经常被应用到，因此，正确熟练地操作应用，在一些动物疫病的免谢谢阅读疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。谢谢阅读感谢阅读接血凝试验的原理,对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指导感谢阅读意义。操作步骤可简化为:①稀释液→②待检血清→③对倍稀释→④感谢阅读血凝抗原→⑤震荡静置→⑥结果判定六个环节。正向间接血凝试验（IHA）1原理感谢阅读精品文档放心下载这种复合物的分子团很小，肉眼看不见.若将抗原吸附（致敏）在经精品文档放心下载过特殊处理的红细胞表面,只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的感谢阅读反应灵敏性.这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相精品文档放心下载遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象.2适用范围主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。3试验器材和试剂3.1孔110°V型医用血凝板,与血凝板大小相同的玻板谢谢阅读3.2微量移液器（50μL25μL）取液塑咀3.3微量振荡器3.4O型口蹄疫血凝抗原3.5O型口蹄疫阴性对照血清3。6O型口蹄疫阳性对照血清3。7稀释液8待检血清(每头约0。分感谢阅读钟4试验方法4。1加稀释液在血凝板上1-6排的—9孔;第7排的—4孔第—7孔；第精品文档放心下载8排的—12孔各加稀释液50μL.4。2稀释待检血清取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，感谢阅读右手拇指轻压弹簧精品文档放心下载50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3孔……直至第9孔混精品文档放心下载匀后取出50μL1排谢谢阅读数）依次为:1：2⑴、：4⑵、1:8⑶、1:16⑷、：32⑸、1:64⑹、谢谢阅读：、1:256⑻、：。取2号待检血清加入第23号待检血清加入第3排……均精品文档放心下载按上法稀释，注意！每取一份血清时,必须更换塑咀一个。谢谢阅读4。3稀释阴性对照血清在血凝板的第7排第1孔加阴性血清4孔，精品文档放心下载混匀后从该孔取出50μL丢弃.此时阴性血清的稀释倍数依次为：2感谢阅读⑴、：4⑵、：8⑶、1：。第—7孔为稀释液对照。感谢阅读4.4稀释阳性对照血清在血凝板的第8排第1孔加阳性血清感谢阅读50μL丢弃.此时阳性血清的稀释倍数依次为1：感谢阅读—：4096。4.5加血凝抗原被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液谢谢阅读对照孔均各加O型血凝抗原充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。感谢阅读4。6振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟，如无振荡器,用手轻拍混精品文档放心下载匀亦可,然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现精品文档放心下载血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5-2小时判定精品文档放心下载结果，也可延至翌日判定。4。7判定标准1:16孔，谢谢阅读感谢阅读精品文档放心下载悬浮。阳性血清对照谢谢阅读合格（少量血球沉入孔底,大部血球悬浮于孔内。在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”精品文档放心下载凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1谢谢阅读—5,第8孔精品文档放心下载第9感谢阅读效价为1:128。接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到7感谢阅读群、羊群免疫抗体效价达到1:256（第8“++”凝集为免精品文档放心下载疫合格.注意事项：收到试剂盒时,应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，感谢阅读用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使谢谢阅读精品文档放心下载精品文档放心下载谢谢阅读别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。谢谢阅读ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked感谢阅读ImmunosorbnentAssay）的简称。ELISA试验是一种敏感性高，谢谢阅读特异性强,重复性好的实验诊断方法。将抗原、抗体免疫反应的特异谢谢阅读精品文档放心下载量的特异性抗体或抗原。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗感谢阅读感谢阅读谢谢阅读精品文档放心下载比例。加入酶反