菌种保存与活化

菌种保存与活化（一） 培养基保存法利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。经35°C培养18〜24h后，移种于4°C冰箱中，一般可保存一个月，每月传代一次。血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35C培养生长后，置4C冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2〜4天移种一次，以后逐渐延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35C孵箱中保存，一般每2天移种一次。鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35C培养18〜24h，再以无菌方法加入灭菌的液体石蜡。高度约lcm，置4C冰箱保存。保存时间可达3〜6个月。（二） 干燥保存法原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。（三）冷冻干燥保存法本法又称冷冻真空干燥法。它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3〜5年，有的可长达10年以上。菌种保管要求2009-11-1615:32【大中小】【我要纠错】应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。液体培养基不适于保存菌种。培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。但应注意，一般细菌大多保存于4°C冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初次分离的流感嗜血杆菌需保存于37C孵箱中。保存菌种应做鉴定记录。在主要培养基上生长情况、菌落特征、形态及革兰染色或特殊染色反应、生化反应、血清学性状以及个别菌种需要的动物试验结果等。保存的菌种应有两套，一套供保存传代用，一套供实验用。定期转种，每转种三代作一次鉴定医学教|育网搜集整理。专人保管和发放，严格保管和发放制度。菌种保藏技术菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。一、 菌种保藏原理菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。二、 菌种保藏的方法1、 低温定期移植保藏法。将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5°C低温干燥处或4°C冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。2、 液体石蜡保藏法。取化学纯液体石蜡（要求不含水分、不霉变）装于三角瓶中加棉塞并包纸，在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时，再放入40C恒温箱中数天，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28-30C下培养2-3天，证明无杂菌生长方可使用。然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待保藏的斜面试管中。注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。保藏时间在一年以上，在低温下，保藏时间还可延长。3、 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2-4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的ph达到中性，烘干备用。同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将处理好的沙与土以（2-4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安甑内，每管装量0.5-2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160°C，2-3小时）1-2次，进行无菌检验，合格后使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2-10年。4、 滤纸片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4X0.8厘米的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟）。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，再将保藏试管放入干燥器中1-2天，除去滤纸水分，使滤纸水分含量达2%左右，然后低温保藏。5、 自然基质保藏法⑴麦粒保藏法：取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净，浸泡12-15小时，加水煮沸15分钟，继续热浸15分钟，使麦粒胀而不破，沥干水分摊开晾晒，使麦粒的含水量在25%左右。将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙、石膏比例为10公斤:133克:33克），拌和均匀后装入试管中，每管约2-3克，然后清洗试管，塞棉塞，灭菌1.5（1.5公斤/平方厘米，2小时），经无菌检查合格后备用，试管基质冷却后接种，适温培养，待菌丝长满基质后用石蜡涂封棉塞，放低温保藏。2年左右转接一次。⑵麸曲保藏法。取新鲜麸皮，过60目筛除去粗粒。将麸皮和自来水按1:1拌匀，装入小试管，每管约装1/3高度，加棉塞用纸包扎，高压灭菌（1.5公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将生长在斜面培养基上的健壮菌种，移种至无菌麸曲管中，移种时注意尽管捣匀小试管中的麸皮，呈疏松状态，在适温下培养至菌丝长满麸皮为止，将麸曲小管置干燥器中，在低温或适温下保藏。6、 生理盐水保藏法。取纯氯化钠0.7-0.9克，放入100%毫升蒸馏水中，搅拌均匀分装试管，每管5-10毫升，进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天。无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中，塞上无菌橡皮塞，用石蜡涂封，在室温或低温保藏。7、 冷冻真空干燥法。将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶制成菌悬液，将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安甑瓶中，每管约0.3-0.5毫升，然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接，安甑瓶放在冷冻槽中于-30°C至-40°C迅速冷冻，并在冷冻状态下抽空干燥，并在真空状态下熔封安甑，在-20°C保存，一般可保存十年以上，但成本较高。8、 液氮超低温保藏法。首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次，准备安甑瓶，每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液，塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米，5分钟）。无菌检查后，接入要保藏的菌种，火焰熔封瓶口，检查是否漏气，将封好口的安甑瓶放在冻结器内，以每分钟下降1C的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至-35C，以后冻结速度就不需控制，安甑冻结后立即放入液氮罐内，在-150至-196C保藏，该法只有少数科研院所使用。2菌种的传代与保存方法（1）*菌斜面 •菌捣面（保存）・培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用，标签上著名茵名及接种E期.至冰箱取出的藤神斜面，应在室温放置约驯分钟，待温度平衡后再移入接种室或翔净工作台., 点燃酒精灯，用左手握住囹种斜面，将管口靠逃火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红50秒，随后将全部接种棒金属剖分在火焰上烧灼，往返通过3次，左手典管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部来住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，冷稣再移至曲昔上，翻去少量幽苔，随即取出按种棒,并将菌样管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将爵种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开福塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接样环桂贴辫面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上“取出接种捧，在火焰旁将培养基管棉塞靖上，然后施种过的接种棒在火焰上烧灼灭菌"”将已接种毕的细留管置35〜37。培养攻＜24小时，釜菌管一般置霉菌培养箱内培养7日，取挡后放人冰箱保存，一般3个月转神一次.方法2：菌斜面营养肉汤余高平板•菌斜面如果菌落形态不典型可纯化•按下列方法传代（分离圉落）t用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉沥中⑸血支，己灭菌），置35-37*培养冷P4小时后，再用接神环取培养好的营养肉汤窗悬液（派菌液），接种于分高平板，置35T7P培养调74小时，用接种针逸典型菌落划线•丁营养蕴康斜面，置35^3710培养出-24小时，一般同时接种几支管，其中一支用于以后用种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种，3菌悬液的制备取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种置营养肉汤中（5ml/支，已灭菌），将已接神毕的细菌管置35璀7亳培养小时，取出备用，一般于冰箱中保存可用7天日4对照用菌液制备• 取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）LmL加到9ml。.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10%再取另一只吸管吸取1胛菌液1加加到9ml0,9%无菌氯化钠溶液混匀，为1卜……以此类推，稀释至含活菌数在50-100个口用平板计。如此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在1天内使用。菌种工祚曹神培养基犬样曹背养琼脂捐面背葬肉Si*-!f1■：It钠耳w~-L沙门曲昔养琼脂料1切营养网询m.就此独市M金黄色角荷球菌音葬琼脂卦而7%lilt朝雷澈官弊肉涌生碟乙辞瑙挂埼葬碗乙博醴曲埔券基t■曲怪机It的博情白色念珠翌真*面心咀机化制拜五、菌种保管圈种保管应有专人负责/保存与加徵的冰箱中或特制的白铁箱中加锄置阴墙处，确保留种安全-因工作变动时，必须做好交接工作。菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期，鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因，-各种南种应按规定时间定期移种#一般每移种3次后作一次全面接定，注意茜种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换.,购置菌种，应有介绍信，全部保存菌种应具备清单「并定期向部门负责人报告，方法2*菌斜面营养肉汤分离平板一菌斜面如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离茜落）;用接种环板上述菌管（斜面〉菌苔少许接种置I营养肉汤中向】成,己灭菌），置3S-37TC培养1424小时后，再用接种环取培养好的菅养肉场菌悬液（浓菌液），接神于分离平板，置35-371C培养1S-24小I时，用接神针选典型菌落划践于营养琼脂斜面，置35-37T培养埒〜24小时.一股同时接种几支管，其中一支用于以后窗种传代或接神到半固体琳脂培养基中，其它用做工作菌种"

1菌种的复苏*冻干凿种管、天菌侦】滴备住隼银子.营养肉词培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台，•菊砂轮将雍干函种安瓶颈部挫出刻痕，再将冻干菌神管外壁用碘酒擦洗消毒、稽干，用75%乙醇棉擦苻，放在天菌双碟内，待干*点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上'烧灼红熟，用灭菌滴管吸取营养肉窿墙养基，滴在灼熟的菌料管封口一端，使骤冷而炸裂。•取灭菌镶子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另耿1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部'将冻干菌搅动促使溶解，随即吸由管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35-371培养22~24L•取出培养物，仔细观察菌苔形志、有无杂菌、涂片、革吁氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落，四、试验用菌种的培养传代方法•程序，踪干菌复 种（斜面）一（菖种传代）〈营养肉扬）制而悬液_对袖液他定用标准菌神，由中国药品生物校定所提供，为冷冻干媒曲种°圜种的更芥与保存在专用无的室或超净工作台内进

3、半固体琼脂培养基(0^%) 4、40%甘油保存法： \2、液体石蜡保3、半固体琼脂培养基(0^%) 4、40%甘油保存法： \本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发'从而延长菌种的保裁期，(1)方法*•将菌神接种于斜面或穿刺于山卜C.5%琼脂半固体高层培养基中,培养好备用，取化学纯的液体右始装在试管中，每管加棉塞，瓶口包上纸，"IT：高压灭菌3伽nin,取出置37。温箱或1HI-170T烤箱中l"h或于燥器内除去液体石蜡中的水分.将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜻液面以高出培养基最上端1m为宜,将试管直立，放入4P冰箱中保藏。适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌利放线菌，对细菌保藏效果较差。液体石蜡对各类菌种保藏效果菌 种菌株数呻时间（年）］存活率<%）细茵酵母菌放线崎«75864IM380552420.983.6制.991.3V<3>特点；本方法筒便易行，是实验室常用的一种保藏方法.蚤法主要使菌种与空气隔筮。<4）注意事项孑I①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度血特狂后，方可进行保藏.保殖过程中，需经常观察斜面是否干爆，如于燥，布重新移种， ■使用菌种时，先将圈种管倾斜使被体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，特长出新培葬物后'再移种一次到新斜面上将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染，液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥,将缩短保藏期口一般以高出斜面1on为宜§制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染』L琼脂斜面低温保存法（i＞方法：将绎常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊国种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜圜种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延於保畿时间，可将菌神保藏管的棉花塞换成割技寒.放在$笆左右的冰箱中保谜.每隔卜3个月移种一次，缥续进行保藏。若用半固体高层培葬基穿刺培养，一般可保藏半年-一年，有的甚至更长时间J（2）适用范围；细菌、酵母菌、霉菌保藏.大肠杆窗斜面 金黄化简萄球^斜面生抱梭苗 白色念珠苗需气菌、质气菌培养基 真菌培养基各类菌种保藏条件及时间萌神培养基保存在度砖种时间站苗一魁多用于嘘根据甯杓埃定靖用培养基ME芽 月，其它翊Iff每个月醉毋藤一般用金芽汁琼眉或惑弟滑醉母膏貌脂-«NS月、皱鼻南股HlPDA琼腊、司氏琼娘或麦芽/踪痼4-filC每4个月碰植一次<^2个月秽捧#次，(3)特点： \优点是一简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基I对大多数微生物都适用口缺点是一保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染"<4)注意事项：保瘢的函种应是生命活力旺盛的新衅培养物，至少应是第三代的培养物. \保藏时，破伤风杆窗可用庖肉培养基；生殉梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基.必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霰，如有异常应及时处理，每次移植后，成与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏C保藏圜种的培养基应无融，其他菌类含精小亍2院为宜，以免产酸过多，影响菌种存活』铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自瘠而死亡■不宜用本法保存-三、常用菌种保藏方法《一}满种保藏的原理根据微生物的菌种生理,生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物