氨基酸、肽类、蛋白质和酶类药物的分析2

贾广韬第八章氨基酸、肽类、蛋白质和酶类药物的分析上次课内容氨基酸的基本性质（两性电解质）茚三酮反应（反应原理、检测波长）紫外吸收（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）酸碱滴定（直接滴定、甲醛滴定）非水溶液滴定（酸碱质子学说，冰醋酸/高氯酸）第二节肽类药物的分析一、概述肽(peptide)是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九。多肽的种类：免疫活性肽、抗菌肽、神经活性肽等。活性肽主要控制人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢。医院里治疗疾病最贵的药物几乎都是肽类的，几乎所有的慢性疾病都必须通过肽类药物治疗！肽具有原蛋白质和单体氨基酸不具备的独特的生理活性和医疗保健作用，具备营养、保健、治疗三重功能。临床肽类药物举例胰岛素【51肽】于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。中国科学院肾病检测研究所主治直至80年代初，用于临床的胰岛素几乎都是从猪、牛胰脏中提取的。不同动物的胰岛素组成均有所差异，猪的与人的胰岛素结构最为相似，只有B链羧基端的一个氨基酸不同。80年代初已成功地运用遗传工程技术由微生物大量生产人的胰岛素，并已用于临床。临床肽类药物举例用于治疗女性子宫内膜异位症和男性前列腺癌症的活性多肽药物醋酸亮丙瑞林【10肽】，全球销售额超过23亿美元（1600元/针）依替巴肽注射液【7肽1毫克8000元】用于抢救心梗患者醋酸格拉替雷治疗硬化症，2011销售额超40亿美元临床肽类药物举例醋酸戈舍瑞林治疗乳腺癌、前列腺癌5-15亿美元临床肽类药物举例2013年临床实验结果：在癌症已经转移并且所有已有治疗方案都无效的黑色素癌症晚期患者身上，这两种药物让60%的患者肿瘤减小乃至消失了超过2年！要知道，这些患者平时的生存时间只能以周计算，而这两种免疫药物让60%以上的患者活了超过2年！因此PD-1从临床试验阶段就一直自带光环，在审批阶段也是获得了FDA的加速批准待遇。抗癌新宠PD-1抑制剂【昂贵的蛋白肽分子、每针30000元】目前很多医生都无权开具的红色处方药，世界上最好的顶级抗菌消炎药万古霉素【复合多肽】临床肽类药物举例万古霉素适用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其它细菌所致的感染：败血症、感染性心内膜炎、骨髓炎、关节炎、灼伤、手术创伤等浅表性继发感染、肺炎、肺脓肿、脓胸、腹膜炎、脑膜炎等。多肽药物的成药性高于一般化学药物，其生物活性高，特异性强，毒性反应相对较弱，在体内不易产生蓄积，与其他药物的相互作用比较少，与体内受体的亲和性比较好。多肽分子的稳定性较差，在体内容易被降解，因而半衰期较短，需要连续给药以维持其药效，给患者带来不便。化学合成、提取临床肽类药物二、鉴别试验（1）紫外分光光度法五肽胃泌素，刺激胃酸、胃蛋白酶等的分泌胃酸分泌功能检查280nm检测二、鉴别试验（2）薄层色谱法Rf值，斑点颜色杆菌肽临床上抗菌谱与青霉素相似，对革兰阳性细菌和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体等均有杀菌作用。二、鉴别试验（3）HPLC（保留时间）（4）生物学法（在体分析法、离体分析法）（5）显色反应抑肽酶+甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐不显紫红色（6）其他（质谱、核磁共振、免疫学）三、检查（1）酸度（2）纯度检查（3）等电点测定（4）吸光度或吸光度比值（分光光度计）（5）热源或细菌内毒素（家兔法，鲎试剂法）（6）氨基酸比值（确定多肽质量，氨基酸在肽链中的个数）不同肽类有不同检查要求，具体以中国药典为准。四、含量检测（1）酸碱滴定法（苯酪肽，P150）取本品0.5g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液呈中性）60mL，振摇，加酚酞指示液，用氢氧化钠标准液（0.1mol/L）滴定四、含量检测（2）紫外分光光度法

五肽胃泌素取本品适量，精密称定，加0.01mol/L氨溶液溶解并定量稀释，在280nm波长处测定吸光度，按吸收系数为70计算比吸光系数法

根据朗伯-比耳定律，若吸光系数已知，即可根据测得的A求出被测物的浓度。通常可以从手册或文献中查到，这种方法也称绝对法。

例如：五肽胃泌素用氨溶液溶解，定量稀释在280nm处的值为70，于1cm吸收池中测得溶液的吸光度为0.700，则溶液浓度为：c=0.700/(70×1)=0.010(g/100ml)标准曲线法取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液度。维生素B12的标准曲线

（2）紫外吸收法

对照品比较法

预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为As，再测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从下式求得四、含量检测（3）效价测定法（杆菌肽，抗生素的微生物检定法）国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下原因：微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素药品的抗菌活性；多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。

抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法（2）比浊法（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

稀释法通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC，minimuminhibitoryconcentration）的方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方面。12345678一一一一一一一一不同浓度的抗生素液体培养基浓稀等量的试验菌菌液比浊法利用抗生素对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。琼脂扩散法（管碟法、打孔法）通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素药物的含量（效价）测定。抑菌圈的形成两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。管碟法测定抗生素效价

原理和方法在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比，可以得出一条曲线。抗生素浓度换算成对数，则抑菌圈直径与抗生素对数成直线关系抗生素的微生物检定法过程标准品溶液、样品溶液配制培养基配制下层培养基上层培养基加样培养抗生素微生物检定方法比较：

四、含量检测（1）酸碱滴定法（苯酪肽，P150）（2）紫外分光光度法（3）效价测定法（4）等不同肽类由不同检查要求，具体以中国药典为准。蛋白类药物优势蛋白类药物面临的问题

高活性、高特异性、低毒性

生物功能明确

有利于临床应用

安全性和利用效率较低（免疫原性、肾消除作用）

生物活性不稳定（pH值、离子强度、温度）

大多数蛋白质类药物仍局限于静脉、皮下和肌肉注射等侵入式给药方式（生产、贮运成本高；易传染疾病；半衰期短）第三节

蛋白质类药物的分析蛋白类药物的分类细胞因子Cytokine由免疫细胞及相关细胞产生的一类调节细胞功能的高活性、多功能多肽分子，不包括免疫球蛋白、补体和一般生理性细胞产物酶类Enzyme催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。抗体Antibody机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。疫苗Vaccine用细菌、病毒、肿瘤细胞等制成的可使机体产生特异性免疫的生物制剂。细胞生长调节因子干扰素白细胞介素神经生长因子肿瘤坏死因子促红细胞生成素通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制造血和免疫调节功能酶类药物健美生消化酶—帮助肠胃蠕动蛋白质类激素垂体蛋白质激素促性腺激素来源于健康的乳猪或未哺乳新生牛新鲜肝脏中提取的具有生物活性的多肽水溶液2023/6/4胶原蛋白明胶阿胶冻干猪皮一、蛋白质类药物的鉴别蛋白质类药物可根据其各自的物理、化学性质、生理作用等采用不同的方法进行鉴别。（1）茚三酮反应（2）福林酚反应或双缩脲反应

（3）紫外吸收（4）生物学法第三节

蛋白质类药物的分析1、分子量检查（常用的蛋白质分子量测定方法？）常用还原型SDS法检查分子量，用量约1μg。也可采用凝胶过滤法；凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量，而SDS是测定蛋白质亚基的分子量二、检查蛋白质产品纯度是一项重要指标，但它也是一项相对的指标，需根据实际要求而定。蛋白质纯度一般是指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。目前较常用的是HPLC法（包括凝胶过滤、各种反相HPLC、离子色谱、疏水色谱等）、非还原SDS凝胶电泳法、毛细管电泳法（CE）、等电聚焦电泳2.纯度检查凝胶过滤中=纯，能否作为判定依据？离子色谱中却分辨为二个组分，反之亦然。凝胶过滤法和SDS电泳证明是纯的，能否作为判定依据？机理相同至少应用两种以上的方法，而且是两种不同分离机理2.纯度检查3、等电点测定等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带电性质。一般采用凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。溶解度、酸碱电位滴定4、吸光度或吸光度比值（紫外吸收）不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。三、蛋白质含量测定和效价测定1、蛋白质含量测定蛋白质的定量可用化学方法如凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法、紫外光吸收法来测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝测定；此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性核素计数等灵敏度较高方法。上述方法中凯氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最为常用，它们操作简单、设备便宜。第三节

蛋白质类药物的分析（1）凯氏定氮法

常用来测定有机物的含氮量。第三节

蛋白质类药物的分析操作方法：1、样品处理：恒重2、消化：准确称量的蛋白质样品转入凯氏烧瓶消化3、蒸馏和吸收：（1）、洗涤：（2）、加样：（3）、蒸馏吸收：4、滴定：5、计算：样品中总氮量（％）＝（A-B）×0.100×14／C×1000A为样品中用去的盐酸平均毫升数，B为空白样品用去的盐酸平均毫升数，C为称样的克数，0.100为盐酸的摩尔浓度，14为氮的原子量。凯氏定氮法优缺点优点：准确，干扰少。注意事项：测试样品中是否还含有其它含氮化合物。适用范围：0.2-1.0mg氮。相对误差小于2％。紫外吸收法（1）280nm波长的测定法（2）280nm与260nm吸收差法（3）215nm与225nm吸收度差法的测定法紫外吸收法是将样品溶液直接在紫外分光光度计下测定的方法。测定后的样品能够回收，操作简单。柱层析蛋白质定量、贵重的蛋白质定量第三节

蛋白质类药物的分析紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。紫外吸收法此法的缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，其干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。紫外吸收法准确度较差，干扰物质多若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。紫外吸收法①280nm光吸收法

（标准曲线法、比吸光系数法）由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质在275～280nm波长处有一个紫外吸收高峰，在一定范围内，蛋白质溶液在280nm波长处的光吸收度值（A280）与其浓度成正比，因此可作定量测定。该法测定范围为0.01～0.1mg/mL。该法简单、灵敏、快速、不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用。第三节

蛋白质类药物的分析②280nm和260nm光吸收差法

（经验公式）若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在用来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。由于核酸在260nm波长处的光吸收比280nm波长处更强，因此可利用280nm和260nm的吸收差来计算蛋白质浓度。常用下列经验公式估算：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280－0.74A260（假设1mg/mL蛋白质溶液的A280为1.0）第三节

蛋白质类药物的分析215nm和225nm光吸收差法

（标准曲线法、经验公式）蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时肽键用已知浓度的标准蛋白质，配制系列梯度的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D=A215－A225

以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线查出未知样品的蛋白质浓度经验公式：蛋白质浓度（mg/ml）=0.144（A215－A225

）第三节

蛋白质类药物的分析考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，可在595nm波长处进行比色测定。该法反应快、操作简便、消耗样品少，但不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。测定范围为0.01～1.0mg/mL蛋白质。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有干扰，缓冲液浓度过高或改变测定液的pH也会影响显色。（3）考马斯亮蓝G-250染色法（4）双缩脲法原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。

540nm比色特点：快速，硫酸胺不干扰，有利于蛋白质纯化的早期步骤测定。范围：1－10mg蛋白质/ml.双缩脲法操作双缩脲试剂：

1.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）

6.0克酒石酸钾钠，用500ml水溶解定容至1000ml300ml10％NaOH溶液，测定：样品（标准品）1ml，加双缩脲试剂4ml，充分混匀，室温放置30分钟，与540nm比色。（5）Folin－酚试剂法（Lowry）原理：蛋白质用碱性铜溶液（酚试剂）处理，使其形成铜蛋白质络合物。该络合物中的酪氨酸、色氨酸能还原磷钼酸－磷钨酸试剂（Folin试剂），产生深蓝色。660nm测定范围0.03~0.25mg/ml灵敏度为双缩脲法的100倍。

原理Folin-酚试剂法（Lowry法）第一步——加碱性铜试剂在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物（双缩脲反应）

第二步——再加入Folin-酚试剂。

在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团（酪氨酸）极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝的混合物，可利用分光光度计测得其OD值实验原理Folin－酚试剂法Folin－酚试剂法定量蛋白质的方法简单、灵敏，是一般实验室最广泛采用的方法。

缺点：蛋白质/蛋白质间测定值差异较大干扰因素多：Tris、EDTA、蔗糖、甘油、糖类、还原剂、金属离子、硫酸胺乙醇、乙醚、丙酮、脂类等化合物对测定有影响。含量测定方法选择

样品小部分是蛋白质1样品丰富时（1）凯氏定氮法（2）色素结合法2样品少时（1）微量凯氏定氮法，（2）色素结合法，（3）Folin－酚试剂法样品大部分是蛋白质1样品丰富时（1）凯氏法（2）双缩脲法（3）紫外光谱吸收法（280nm）2样品少时（1）紫外光谱吸收法（215-225nm）（2）色素结合法（3）Folin－酚试剂法（4）微量双缩脲法3样品连续地产生时（1）紫外光谱吸收法，（2）Folin－酚试剂法（3）微量双缩脲法蛋白质药物分析实例：胰岛素

本品为自猪、牛等食用动物胰脏提取而得的高纯度蛋白质，是胰脏β细胞分泌的激素，能降低血糖，为重要的蛋白质类药品。

本品为五十一肽，分子量约5700。晶体胰岛素含锌约0.4%。等电点5.30～5.35。在pH2.5～3.5微酸溶液中稳定，微碱溶液中不稳定，遇蛋白酶、强酸、强碱均能破坏。胰岛素【性状】本品为白色或类白色的结晶性粉末。在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶，在无机酸或氢氧化钠中易溶。【鉴别】（1）取本品10mg，加用酸调节pH2.5~3.0水6ml，应能完全溶解，调pH5.3，即发生沉淀，调pH8.0~8.5，溶解。（等电点5.30～5.35）。（2）HPLC：十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，检测波长214。（与同种属对照品主峰保留时间一致）。（3）取本品适量，加用酸调节pH2.5~3.0的水制成每1ml中含5单位的溶液。在20~30℃条件下，取体重20~40g的小鼠5只，按每20g体重皮下注射上述溶液0.25ml，注射后2小时内，至少应有4只小鼠发生惊厥。立即给惊厥的小鼠腹腔注射10%的葡萄糖注射液1ml，使惊厥停止。检查吸收度：取本品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml含0.5mg的溶液，照分光光度法测定，在276nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.48~0.55。有关蛋白质：取胰岛素标准品适量，精密称定，用尿素溶液制成每100μl含0.5μg，1.0μg，3.0μg，5.0μg，及100μg的溶液。取供试品适量精密称定，用尿素溶液制成每100μl含100μg及500μg的溶液照聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，胶条染色后，目测比较各色带的颜色。

(1)标准品色带应有明显的梯度；（2）100μg及500μg供试品管，主带位置应与标准品100μg主带位置一致；（3）100μg供试品管与标准品100μg主带后泳动较快的一条色带，颜色不得深于标准品3.0μg；（4）500μg供试品管与标准品100μg相应的主带后泳动较慢的一条色带，颜色不得深于标准品0.5μg。检查大分子蛋白质：取供试品约100mg，精密称定，用1mol/L醋酸溶液制成每1ml中含50mg的溶液。照柱色谱法，葡聚糖凝胶G-50，色谱柱长80cm、内径2cm；洗脱剂为1mol/L醋酸溶液，检测波长280nm，流速每小时22~25ml，供试品溶液加入量为0.6ml。主峰前洗脱的面积之和应不大于所有洗脱峰面积的1%。氮：取本品10mg，精密称定，照氮测定法测定，按干燥品计算，含