石榴脱毒苗木繁育技术规程

石榴脱毒苗木繁育技术规程Pomegranatevirus-freeseedlingpropagationtechniquesoforder范围本文件规定了石榴种苗组培生产过程的环境要求、组培技术和管理。本文件适用于石榴种苗组培繁育。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则LY/T1893石榴苗木培育技术规程NY/T357-2007香蕉组培苗DB34/T3410石榴生产技术规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

石榴组培苗plantletsofpomegranates根据植物细胞具有全能性的理论，利用石榴茎尖作为外植体，在无菌条件下通过人工培育出完整石榴植株。

脱毒苗virus-freeseedlings脱毒苗是指不含有该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木，植物体内除去病毒常用方法有热处理法和茎尖脱毒法，其中茎尖脱毒法更适用于石榴组培苗的生产。

茎尖脱毒virus-freetechnologyofplantshoottip病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此采用茎尖接种的离体培养方式，可以达到脱除植物病毒的目的，该方式也是木本植物组织培养最常用的脱毒方式。

褐化browning由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞内的酚类化合物聚合成暗黑色的大分子物质，在后期培养中，这种变色物质会使培养物褐化，影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。环境要求准备室用于组培药品配置、器具洗涤及灭菌等，面积≥15m2，温度为20-28℃。缓冲室室外与接种室或组培室的隔离缓冲区间，应具备换衣区、鞋区、风淋区，面积≥2m2。接种室用于外植体消毒、茎尖剥取、接种、扩繁培养等无菌操作，单间接种室面积≥10m2，高度≤30m。接种室要求严格无菌，应具备超净工作台，室内应吊装紫外线灭菌灯，其辐射强度应＞70VW/cm2（距离1m处）。每2-3d进行一次紫外消杀灭菌，1-2月进行一次甲醛熏蒸消杀灭菌处理，室内温度一般保持23±3℃，湿度在50-70%之间。培养室用于组培苗的培养，面积≤50m2，方便隔离和消杀。培养室要求严格无菌，应具备培养架，室内应吊装紫外线灭菌灯，其辐射强度应＞70VW/cm2（距离1m处）。每1-2月进行一次甲醛熏蒸消杀灭菌处理，培养室环境应为相对湿度50-70%、光照强度2000-5000Lx、光照周期16L:8D，且光照条件下的温度为23-27℃、避光条件下的温度为14-18℃。炼苗室用于组培苗由人工无菌环境过渡到室外自然有菌环境的过渡区，室内应具有自动喷雾或加湿条件，能够人工调节控制光源。炼苗室培养条件为温度25±2℃，相对湿度65%±5%，光照1000-5000Lx，可自动调节。移栽温室移栽宜选择在可控温、湿度的温室内进行，带有避光设施，避光率宜在25%-50%。移栽培养条件为温度15-25℃，相对湿度35%-55%，光照条件为自然光照，光照时间过于强烈宜采取遮光措施。组培技术技术路线组培技术路线：取样→接种和培养（茎尖接种→扩繁培养→生根培养）→病毒检测→炼苗→移植。组培技术取样选取果实品种优异、无病虫害、长势健壮的石榴树作为取样母株。选取健康、幼嫩、无病害的新发枝条，放置于培养室内水培2-3d。接种和培养培养基的配置培养基采用WPM基本培养基，以6-BA、IBA为常用激素，活性炭作为去除褐化常用吸附剂，不同生长过程培养基配方如下：茎尖接种培养基：·L-1+X脂6g·L-1+蔗糖25g·L-1+活性炭0.6g·L-1；扩繁培养基：WPM+6-BA0.4-0.6mg·L-1+X脂6g·L-1+蔗糖25g·L-1+活性炭0.2g·L-1；生根培养基：WPM+IBA0.5mg·L-1+X脂6g·L-1+蔗糖25g·L-1。接种剪取茎尖顶端1-2cm作为接种外植体，采用0.1%HgCl2和无菌水对外植体灭菌，在操作室内无菌环境下，通过解剖镜，剥取茎尖生长点，剥取长度为0.1-0.15mm，接种在添加活性炭的灭菌培养基中，每个生长点要求插入培养基0.03±0.01mm，尖端露出培养基，培养室内培养30-40d。扩繁选取通过茎尖生长点发育出的石榴幼嫩组培苗作为外植体，切去增生愈伤后，接种于快繁培养基中，培养室内培养25-35d。生根选取快繁后的石榴不定芽，切取1-1.5cm的茎段作为外植体，将苗竖直插入生根培养基0.3±0.05cm中，培养室内培养30d。病毒检测按照NY/T357-2007的规定执行。炼苗选取长势健壮，生根长度为0.6-0.8cm，带有毛状根的石榴组培苗作为选育植株，放置炼苗室内打开组培瓶盖，光照1000-2000LX条件下炼苗1-2d，光照3000-5000LX炼苗2-3d。