醋酸菌培养条件的优化及醋酸分批发酵

醋酸菌培养条件的优化及醋酸分批发酵来源：生物化学资料网摘要：目的醋酸菌培养条件的优化与醋酸发酵实验。方法通过正交试验确定最佳培养条件，并在优化条件下进行分批发酵。结果优化培养条件为:葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L,乙醇10%(v/v),pH5.5,装量50mL/500mL,静置培养5d。在优化条件下，醋酸产量比用普通产酸培养基提高了36.4%。应用于分批发酵试验产酸较高。结论优化培养条件适合醋酸菌生长与醋酸发酵。关键词:醋杆菌属巴氏醋杆菌；培养条件;正交设计;分批发酵山西老陈醋不仅是具有“绵、酸、香、甜、鲜”独特风味的调味品，还因其富含多种氨基酸、维生素和微量元素而作为保健品得到广泛使用。近年山西醋业发展迅猛，生产规模日渐扩大，生产技术日新月异，促进了山西老陈醋的发展。在食醋生产中，菌种起着至关重要的作用。一株优良的生产菌株能起到提高产量、稳定质量的目的。本实验室从醋醅中分离到一株醋杆菌属巴氏醋杆菌S12,经N+离子注入诱变获得高产突变株SM12-87。对其培养条件进行了优化设计，得出了最佳培养条件。在正交试验对醋酸菌发酵条件掌握的基础上，通过液态分批发酵对优化后的培养条件进行检验。在67h生产出92.8g/L的醋酸，乙醇转酸率达到90.08%,极大地缩短了生产周期，减少了成本。1仪器与材料1.1材料山西老陈醋醋醅(由山西老陈醋集团有限公司提供);醋杆菌属巴氏醋杆菌(Acetobacterpast-eurianus)SM12-87(本实验室保存)。1.2主要设备仪器全自动式5L发酵罐(Edison.N.J.,USA);GC9800型气相色谱仪(上海科创公司)；HQL150B型恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂)。1.3培养基青岛高科技工业园海博生物技术有限公司——专业提供微生物培养基qq:1203100478tel:0532-809259661.3.1产酸培养基葡萄糖10g/L,酵母膏10g/L,pH5.5,分装于500mL三角瓶，每瓶100mL,121°C灭菌20min,使用前加入7%(v/v)无水乙醇。1.3.2发酵培养基葡萄糖10g/L,酵母膏10g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,硫酸镁0.5g/L,pH5.5,121C灭菌20min,冷却至60C以下加入10%(v/v)无水乙醇。1.4培养条件优化试验［1］利用正交表L27(313)设计试验，见表1。分析各因素对醋酸产量的影响。表1因素水平表D1,D2,D3分别代表50mL培养基在500mL三角瓶中以100r/min振荡培养，150r/min振荡培养，静置培养。1.5最佳接种量、培养温度和酒精度的选择醋酸菌SM12-87在优化培养条件下，以不同接种量、培养温度和乙醇含量进行培养，选择最佳接种量、培养温度和酒精度。1.6优化培养条件的验证试验醋酸菌SM12-87在优化培养条件下培养，以优化前的产酸培养基在30°C,100r/min摇床培养3d作为对照。测定总酸度和乙酸乙酯含量。1.7检测方法总酸度的测定:滴定法［2］。乙酸乙酯测定:气相色谱测定法［3］。乙醇转酸率计算公式［4］:还原糖测定:3,5-二硝基水杨酸法［5］。氨基氮测定：甲醛滴定法［6］。1.8醋酸菌SM12-87的分批发酵试验［7］利用优化培养条件配制发酵培养基，用全自动5L发酵罐进行醋酸分批发酵。2结果与讨论2.1培养条件根据单因子试验，影响醋酸产量的主要因素有:葡萄糖+酵母膏，乙醇含量,pH,溶氧，培养时间。采用L27(313)正交表进行培养条件优化试验。实验结果见表2、表3。表2以醋酸产量为检测指标的正交试验直观分析表由极差分析的R值可以看出，影响产酸的各因素主次顺序为D>E>A>C>B;最佳工艺条件为A2B1C2D3E3。表3以醋酸产量为检测指标的正交试验方差分析表**表示影响高度显著;*表示影响显著F1-0.1(2,12)=2.81,F1-0.05(2,12)=3.89,F1-0.01(2,12)=6.93F1-0.1(4,12)=2.48,F1-0.05(4,12)=3.26,F1-0.01(4,12)=5.41由方差分析表可见,D对醋酸菌的产酸影响高度显著,A、E对醋酸菌的产酸影响显著，A与B、A与C的交互作用对产酸有一定影响,A与D的交互作用对产酸影响不显著。从方差分析可知，溶氧条件D3对产酸影响非常显著。由此可见,醋酸菌虽然是好氧菌,但过高的溶氧对醋酸菌的生长和产酸都是不利的。由直观分析表和方差分析表可知最佳工艺条件为:葡萄糖10g/L,酵母膏10g/L,乙醇10%(v/v),初始pH值5.5,相对装量50mL/500mL,静置培养5d。2.2接种量、培养温度及乙醇含量对醋酸产量的影响醋酸菌SM12-87在优化条件下，以不同接种量、培养温度及乙醇含量静置培养5d,测定醋酸产量。不同条件对醋酸产量的影响，10%的接种量产酸最高，达89.23g/L。接种量低会延长延滞期，静置培养5d产酸值达不到最高;接种量过高会导致菌体过早衰老、自溶，产酸值也减少。温度/°C30C下培养产酸最高，达91.3g/L。由此表明30C为醋酸菌SM12-87的最适培养温度。在10%的乙醇含量下，醋酸产量最高。说明醋酸菌SM12-87虽然具有很强的耐乙醇能力，但高于10%(v/v)的乙醇含量会抑制该菌生长和产酸，乙醇转化率也会显著降低；当乙醇含量低于10%时，生长速率、产酸速率和酒精转化率都较高,但总酸度相对较低。2.3优化培养条件的验证优化前后的培养条件下醋酸和乙酸乙酯产量，正交试验确定的培养条件是可行的。2.4醋酸菌SM12-87的分批发酵试验2.4.1醋酸液态深层发酵将高产突变醋酸菌株SM12-87扩大培养至对数期后期，以10%的接种量接入发酵罐中，乙醇含量10%(v/v),调节生长阶段温度为30C~33C,产酸阶段温度为30C,通气量前期和后期为1：0.1(v/v)/min、中期为1：0.12(v/v)/min。连续2次测定酸度未上升或下降，发酵结束。2.4.2分批发酵实验与发酵动力学参数发酵过程主要参数变化。从菌体生长曲线可知,菌体在0~5h为延滞期,5〜15h为对数期,15~58h为稳定期,58~67h进入衰亡期。在对数期，醋酸的增加随菌体的增加而增加;在稳定期，醋酸菌菌体数量不再增加，但醋酸产量继续增加;进入衰亡期产酸逐渐停止。由此可见该菌株合成醋酸是部分生长关联型。此次分批发酵，总酸度达92.8g/L，乙醇转酸率为90.08%,至发酵结束，平均产酸速率为1.389g・L-1・h-1。3讨论验证实验的结果可以看出，通过正交试验确定的优化培养条件是合理可靠的，满足了该菌株的生理学要求。巴氏醋杆菌是一种耐酒精能力强、醋酸产量高的醋酸菌株，它在10%(v/v)酒精度下生长旺盛，静置培养5d,总酸度可达91.67g/L。在乙醇含量为10%(v/v)的发酵培养基中液态分批发酵67h,得到总酸度为92.8g/L的液态醋。由于产酸速率加快,发酵时间缩短，乙醇挥发减少，酒精转化率达到90.08%,同时也减少了电耗，减轻了劳动量，降低了成本，显示了液态发酵在制醋上的优势。参考文献杨秀芬，邱德文,焦宁宁，等.致病杆菌D43菌株产素培养基及发酵条件[J].中国生物防治，2006,22(1):58-62.大连轻工业学院等合编.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1994:118-121.傅若农.色谱分析概论[M].北京:化学工业出版社,2000:152.陈伟.优质醋酸菌的