M453营养毕业论文-14食品质量与安全1班陈婉芬翻译

韶关学院课程考核课程名称：《专业英语与论文检索写作》题目：从猴头菇的干燥子实体中分离新漆酶翻译学生姓名：陈婉芬学号（院）：英东食品科学与工程学院专业：食品质量与安全班级：14食品质量与安全1班授课教师姓名及职称：刘永吉邹秀容讲师完成时间：2017年6月13日从猴头菇的干燥子实体中分离新漆酶H.X.Wanga,T.B.Ngb,*

a微生物系，中国农业大学，北京，中国

b生物化学系，医学院，香港中文大学，沙田，新界区，香港，中国

于2004年6月18日收到

可在线2004年8月3日摘要：具有新型N-末端序列的漆酶，分子量为63kDa，从猴头蘑菇的干子实体中分离出的对HIV-1逆转录酶(IC50=9.51M)具有抑制活性的作用。采用DEAE-纤维素，CM-纤维素和Q-Sepharose离子交换色谱法和休珀代克斯75快速蛋白质液相色谱-凝胶过滤的色谱法。漆酶吸附在DEAE-纤维素和Q-Sepharose上，但未吸附在CM-纤维素上。在pH3-5和50-80℃下观察到酶的高活性。其活性在pH8和9以及煮沸10分钟后完全消失。温度为50℃，pH5.0为最佳活性。©2004ElsevierInc.保留所有权利。关键词：漆酶;HIV;蘑菇AnewlaccasefromdriedfruitingbodiesofthemonkeyheadmushroomHericiumerinaceumAbstract:AlaccasewithanovelN-terminalsequence,amolecularmassof63kDa,andinhibitoryactivitytowardHIV-1reversetranscriptase(IC50=9.5lM)wasisolatedfromdriedfruitingbodiesofthemonkeyheadmushroomHericiumerinaceum.AchromatographicprocedureinvolvingionexchangechromatographyonDEAE-cellulose,CM-cellulose,andQ-Sepharoseandfastproteinliquidchromatography-gelfiltrationonSuperdex75wasemployed.ThelaccasewasadsorbedonDEAE-celluloseandQ-SepharosebutunadsorbedonCM-cellulose.HighactivityoftheenzymewasobservedatpH3-5andat50-80℃.ItsactivitywascompletelyabolishedatpH8and9andafterboilingfor10min.Atemperatureof50℃andapHof5.0wereoptimalforitsactivity.©2004ElsevierInc.Allrightsreserved.Keywords:Laccase;HIV;Mushroom目录摘要 I\o"CurrentDocument"1前言 1离心匀浆，保存得到上清液 1检测漆酶活性 1分析N-末端氨基酸序列 2测定HIV-1逆转录酶抑制活性 2\o"CurrentDocument"结果 2\o"CurrentDocument"讨论 3参考文献 5从猴头菇的干燥子实体中分离新漆酶H.X.WangT.B.Ng前言蘑菇富含了各种生物分子，包括凝集素［1,2］，核糖核酸酶［3］，核糖体灭活蛋白［4,5］和多糖。阐述了猴头蘑菇所含的多糖还具有抗肿瘤活性［6］。然而，关于其他生物化学成分还没有深入了解。漆酶是由木质素分解蘑菇产生的一组酶［7,8］。他们发现在纺织染料，生物传感器，制浆和污水解毒等方面都发挥着它的潜在作用［9-14］。尽管或许只有一些蘑菇物种的基因存在众多的蘑菇物种，但它们有些已被分离出来［15-31］。材料和方法离心匀浆，保存得到上清液将三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（IM,pH7.4）加入到上清液中，直到三羟甲基氨基甲烷盐的浓度达到10mM。将上清液放在5Rcm的DEAE-纤维素（Sigma）柱上进行色谱分离，未吸附级分（D1）的用10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液（pH7.2）洗脱，并丢弃没有漆酶活性的，而具有漆酶活性的吸附级分（D2）用起始缓冲液中的0.5MNaCl洗脱。用相同的缓冲液洗脱未吸附的蛋白质（级分CM1），同时用线性NaCl梯度洗脱吸附的蛋白质（级分CM2和CM3）0-1M）的10mMNH4OAc缓冲液（pH4.5）中。在除去没有漆酶活性的未吸附的蛋白质（级分Q1）后，在10mMNH4HCO3缓冲液中用线性浓度（0-1M）的NaCl梯度洗脱吸附的蛋白质（级分Q2和Q3）。检测漆酶活性通过测定2,70-氮杂双［3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸］二铵盐（ABTS）的氧化来测定漆酶活性［18］。Shin和Lee的方法的检测。将酶等分试样在30℃下，在含有1.54mMABTS的1.3ml67mM乙酸钠缓冲液（pH4.5）中温育。在电泳结束时，用考马斯亮蓝染色凝胶。使用已用分子质量标准品（AmershamBiosciences）校准的休珀代克斯75（Superdex75）HR10/30柱进行FPLC凝胶过滤。分析N-末端氨基酸序列使用HPG1000A埃德曼降解单元和HP1000HPLC系统进行氨基酸序列分析。测定HIV-1逆转录酶抑制活性鉴于蘑菇漆酶这一活动［33］的报告，纯化的漆酶被测试了这项活动。根据Boehringer-Mannheim（德国）的测定试剂盒提供的说明书进行HIV逆转录酶抑制活性测定，该测定法利用逆转录酶合成DNA的能力，从模板/引物杂交聚（A）寡聚（dT）15开始。相对于没有所述蛋白的控制作为，计算分离出的蛋白质的抑制活性的抑制百分比差别不大［33,34］。结果在10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液（pH7.4）中吸附在DEAE-纤维素上并用0.5MNaCl洗脱的猴头菇的子实体提取物的部分，随后在10-mMNH4OAc缓冲液（pH4.5）中未吸附在CM-纤维素上，在Q-Sepharose上分级分离成小的未吸附峰Q1和两个较大的吸附峰Q2和Q3（图1）。该酶在煮沸10分钟后失去其所有活性。漆酶活性在pH3-5范围内没有显着变化。当pH升至6,然后升至7时，活性突然下降。在pH8和9（图5）下，没有明显的活性。图1图5讨论猴头菇漆酶的分子量落在其他蘑菇漆酶报道的分子量范围内［18,31］。猴头菇漆酶对DEAE-纤维素的吸附符合来自陆地毛利亚土壤和木质素的漆酶吸附在DEAE-葡聚糖纤维素上的报告［16,17］，但与鸡油菌，巨大口蘑菌丝和散放多孔菌的漆酶无法结合DEAE-纤维素［30-32］相反。像吸附在阴离子交换剂上的亚硫酸纸浆废液-铬凝胶漆酶［18］一样，猴头菇漆酶吸附在Q-Sepharose上。与吸附在H-trapSP和MonoS［18］上的鸡油菌漆酶和吸附在CM-纤维素上的巨大口蘑菌丝漆酶相比，猴头菇漆酶在CM-纤维素上未被吸附。从前面的阐述可以看出，不同的蘑菇漆酶可能具有不同的pH和温度最佳和离子交换器的色谱行为。猴头菇漆酶具有其自身的特点。参考文献[1]F.Yagi,M.Miyamoto,T.Abc,T.Minami,K.Tadera,I.J.Goldstein,Purificationandcarbohydrate-bindingspecificityofAgrocybecylindracealectin,Glycoconj.J.14(1997)281-288.H.X.Wang,T.B.Ng,W.K.Liu,V.E.C.Ooi,S.T.Chang,IsolationandcharacterizationoftwodistinctlectinswithantiproliferativeactivityfromtheculturedmyceliumoftheediblemushroomTricholomamongolicum,Int.J.Pept.ProteinRes.46(1995)508-513.H.Kobayashi,N.Inokuchi,T.Koyama,H.Watenabe,M.Iwami,K.Ohgi,M.Irie,PrimarystructureofthenonspecificandadenylicacidpreferentialribonucleasefromthefruitbodiesofLentinusedodes,Biosci.Biotechnol.Biochem.55(1992)2003-2010.H.X.Wang,T.B.Ng,Isolationandcharacterizationofvelutin,anovellow-molecular-weightribosome-inactivatingproteinfromwintermushroom(Flammulinavelutipes)fruitingbodies,LifeSci.68(2001)2151-2158.S.K.Lam,T.B.Ng,Firstsimultaneousisolationofaribosomeinactivatingproteinandanantifungalproteinfromamushroom(Lyophyllumshimeiji)togetherwithevidenceforsynergismoftheirantifungaleffects,Arch.Biochem.Biophys.3939(2001)271-280.C.S.Evans,M.V.Dutton,F.Guillen,R.G.Veness,Enzymesandsmallmolecularmassagentsinvolvedwithlignocellulosedegradation,FEMSMicrobiol.Rev.13(1994)235-240.C.F.Thurston,Thestructureandfunctionoffungallaccases,Microbiology140(1994)19-26.G.Palmieri,P.Giardina,L.Marzullo,B.Desiderio,G.Nitti,R.Cannio,G.Sannia.StabilityandactivityofaphenoloxidasefromtheligninolyticfungusPleurotusostreatus,Appl.Microbiol.Biotechnol.39(1993)632-636.O.Brenna,E.Bianchi,Immobilizedlaccaseforphenolicremovalinmustandwine,Biotechnol.Lett.16(1994)35-40.A.L.Ghindilis,A.Makower,F.F.Bier,F.W.Scheller,Alaccase-glucosedehydrogenaserecycling-enzymeelectrodebasedonpotentiometricmediatorlesselectrocatalyticdetection,Anal.MethodsInstrum.2(1995)129-132.L.Martirani,P.Giardina,L.Marzullo,G.Sannia,ReductionofphenolcontentandtoxicityinoliveoilmillwastewaterswiththeligninolyticfungusPleurotusostreatus,WaterRes.30(1996)1914-1918.G.Palmieri,P.Giardina,B.Desiderio,L.Marzullo,M.Giamberini,G.Sannia,Anewenzymeimmobilizationprocedureusingcopperalginategel:applicationtoafungalphenoloxidase,EnzymeMicrobiol.Technol.16(1993)151-158.I.D.Reid,M.G.Paice,Biologicalbleachingofkraftpulpsbywhite-rotfungiandtheirenzymes,FEMSMicrobiol.Rev.13(1994)369-376.A.Leonowicz,M.Malinowska,PurificationoftheconstitutiveandinducibleformsoflaccaseofthefungusPholiotamutabilisbyaffinitychromatography,ActaBiochim.Pol.29(1982)219226.M.A.Pickard,D.W.Westlake,Purification,propertiesandsubstratespecificityofaninduciblelaccasefromPolyporusversicolor,Can.J.Biochem.48(1970)1351-1358.K.S.Shin,Y.J.Lee,Purificationandcharacterizationofanewmemberofthelaccasefamilyfromthewhite-rotbasidiomyceteCoriolushirsutus,Arch.Biochem.Biophys.384(2000)109-115.M.Cambria,A.Cambria,S.Ragusa,E.Rizzarelli,Production,purificationandpropertiesofanextracellularlaccasefromRigidoporuslignosus,ProteinExpress.Purif.18(2000)141-147.T.Fukuda,H.Uchida,Y.Takashima,T.Uwajima,T.Kawabata,M.Suzuki,DegradationofbisphenolAbypurifiedlaccasefromTrametesvillosa,Biochem.Biophys.Res.Commun.284(2001)704-706.J.Fernandez-Larrea,J.Stahl,IsolationandcharacterizationofalaccasegenefromPodosporraarserina,Mol.Gen.Genet.252(1996)539-551.S.Chen,W.Ge,J.A.Buswell,Biochemicalandmolecularcharacterizationofalaccasefromtheediblestrawmushroom,Volvariellavolvacea,Eur.J.Biochem.271(2004)318-328.R.M.Berka,P.Schneider,E.J.Golightly,S.H.Brown,M.Madden,K.M.Brown,T.Halkier,K.Mondorf,F.Xu,CharacterizationofthegeneencodinganextracellularlaccaseofMyceliophthorathermophilaandanalysisoftherecombinantenzymeexpressedinAspergillusoxyzae,Appl.Environ.Micro-biol.63(1997)3151-3157.C.Eggert,P.R.LaFayette,U.Teng,K.E.Eriksson,J.F.Dean,MolecularanalysisofalaccasegenefromthewhiterotfungusPycnoporuscinnabarinus,Appl.Environ.Microbiol.64(1998)1766—1772.M.Schener,R.Fisher,PurificationandcharacterizationoflaccaseIIofAspergillusnidulans,Arch.Microbiol.170(1998)78—84.P.M.Coll,J.M.Fernandez-Abalos,J.R.Villanueva,R.Santamaria,P.Perez,Purificationandcharacterizationofaperoxidase(laccase)fromthelignin-degradingbasidiomycetePM1(CECT2971),Appl.Environ.Microbiol.59(1993)2607—2613.C.R.Perry,S.E.Matcham,D.A.Ward,C.F.Thurston,ThestructureoflaccaseproteinanditssynthesisbythecommercialmushroomAgaricusbisporus,J.Gen.Microbiol.139(Pt.1)(1993)171-179.M.Sakheimo,M.L.Niku-Paavola,J.K.Knowles,Isolationandstructuralanalysisofthelaccasegenefromthelignin-degradingfungusPhlebiaradiata,J.Gen.Microbiol.137(Pt.7)(1991)1531-1544.A.Sethuraman,D.E.Akin,K.E.Eriksson,ProductionofligninolyticenzymesandsyntheticligninmineralizationbythebirdsnestfungusCyathusstercoreus,Appl.Microbiol.Biotechnol.52(1999)689-697.R.Tinoco,M.A.Pickard,R.Vazquez-Duhalt,KineticdifferencesofpurifiedlaccasesfromsixPleurotusostreatusstrains,Lett.Appl.Microbiol.32(2001)331-335.A.M.Garzillo,M.C.Colao,V.Buonocore,R.Oliva,L.Falcigno,M.Saviano,A.M.Santoro,R.Zappala,R.P.Ronomo,C.Bianco,P.Giardina,G.Palmieri,G.Sannia,StructuralandkineticcharacterizationofnativelaccasesfromPleurotusostreatus,RigidoporuslignosusandTrametestrogii,J.ProteinChem.20(2001)191-201.H.X.Wang,T.B.Ng,Anovellaccasewithfairthermostabilityf