抗体的提取与纯化

］抗体的提取与纯化抗体的提取与纯化（关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG；离子交换层析）精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。一、 盐析法取xml血清加xml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。&4°C,3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。山置4C3h以上，［此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%］重复上述第二步过程1〜2次。末次离心后所得沉淀物为Y-球蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。山对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。二、 冷酒精沉淀法分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7（士）冷却到0C。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20C）到最终浓度为20%，保持在-5C。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15〜20mol/LNaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B）,包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4,加冷酒精（-20C〜-30C）到最终浓度为25%，维持在-5C。所得到的沉淀（C）含有90%〜98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0C水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01〜0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在-2C或-3C低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。表2-5从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件物种pH沉淀条件IgG产量酒精浓度（%）离子强度人5.115.0.0165山羊5.200.0165家兔5.2100.0170大鼠5.0150.0150豚鼠5.1150.0170三、DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白原理：DEAE-SephadexA-50（二乙氨基一乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的Y球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85〜7.5）,其余均属酸性蛋白。PH7.2〜7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有Y球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，Y球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.（一）操作步骤1．DEAE-SephadexA-50预处理称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。2．装柱（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。（2） 将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2〜3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。（3） 关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。3．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速12〜14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。4．加样及洗脱启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应＜床体积2%，蛋白浓度以＜100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2〜3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12〜14滴/min。5．收集开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3〜5ml。共收集10〜15管。6．测蛋白以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。7．合并、浓缩将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4°C保存备用。长期保存时应贮于-40°C冰箱。8．A-50凝胶的再生在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的0D280nm＜0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4C保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50C温箱烘干，装瓶内保存。（二）注意事项（1） 柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。（2） 纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。四、 SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG及IgG亚类（一）原理葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。（二）操作步骤用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。装柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22ym滤膜过滤，上样前用1mol/LpH9.0Tris液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。加样，一般按25〜30mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为＜0.02。用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。I用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。I收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。（三）试剂器材（1） SPA-SepharoseL-4B（pharmacia）（2） 磷酸缓冲液0.1mol/LpH8.0+0.02%NaN3（3） 枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.00.1mol/LpH4.0+0.02%NaN30.1mol/LpH3.0（4） 1mol/LpH9.0Tris溶液（5） 再生缓冲液:①0.1mol/LTris含0.5mol/LNaCl调整pH至8.5+0.02%NaN3:②。.1mol/L醋酸钠含0.5mol/LNaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。（四）注意事项（1）SPA-SepharoseCL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10〜20次左右。方法:先用10倍柱体积0.1mol/LpH8.5Tris含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/LPH8.0磷酸缓冲液平衡，4°C贮存。（2）SPA-SepharoseCL-4B亲合层析法还可用于:①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。五、 高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSKDEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。（一）原理根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbY球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。（二）操作步骤腹水离心10000g,10min,除去细胞和杂质，在4°C下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵山搅拌20〜30min离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5,20mmol/LTris缓冲液）透析除盐&4C过夜用带有1000山样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSKDEAESPW离子交换层析柱I洗脱流速1ml/min0〜1min:0T5%缓冲液B（20nmol/LTris,Ph8.5,含2.0mol/L醋酸钠）1〜2min（线性梯度洗脱）：5T20%缓冲液B20〜22min：20T0%缓冲液BI洗脱液用紫外280nm进行监测收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定（三） 试剂和器材（1）TSKDEAESPW离子交换层析柱（75mmx7.5mm,BioRad）（2） 高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）（3） PBS，缓冲液A和Bo（四） 注意事项（1） 所用缓冲液和加样粗提物均需0.2|im滤膜过滤。（2） 在本实验条件下，lgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12mino但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间（retentiontime）有所差异。【附录】制备单克隆抗体常用的试剂1.RPMT-1640培养液其中含2mmol/L谷氨酰胺，25mmol/LHepes,5x10-5mol/L2-巯基乙醇2.RPMT-1640完全培养液上述溶液加10%〜20%灭活小牛血清HT母液x100次黄嘌吟(H)1.0x10-2mol/L136.1mg胸腺嘧淀核苷(T)1.6x1