鸡胚法病毒分离培养作业指导书

作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—121.目的规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。依据标准《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A＜仅限A1，A2.1＞,附录G《全国流感监测技术指南》附件1＜一、四、五〉适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定实验室生物安全级别及个人防护对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。标本的采集、处理和储存5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4°C冰箱，并马上送至实验室。标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维）用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。5.2标本处理实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。标本经以上处理后置4C，待其自然沉淀5〜10分钟，取上清液直接接种或低温保存。如采样液中未加抗菌素，接种前应补加庆大霉素终浓度为0.1mg/ml，抗真菌药物终浓度为2mg/ml。混匀作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—12置4°C过夜或室温作用2〜4小时即可接种。5.3标本保存24小时内能进行接种的样本可置于4C保存；如未能接种，应S-70C或以下保存。不应保存在-20Co流感病毒的分离程序6.1鸡胚分离程序流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2,实验操作人员需进行BSL-2级防护。流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在上述级别实验室的生物安全柜中进行。6.1.1试验材料的准备：9〜11日龄SPF鸡胚照卵灯70%〜75%酒精一次性1ml注射器，22号针头鸡卵开孔器胶水或医用胶布15mL无菌离心管、试管架10mL无菌移液管无菌镊子6.1.2验卵1） 用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉。2） 如何判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限6.1.3鸡胚接种及培养观察1） 鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡叫通常每个样本接种3个鸡胚。2） 70%〜75%酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔。每份标本接种3个鸡胚。3） 1ml注射器吸200RL处理过的临床标本，装上22号针头。4） 胚置于蛋架上，针头完全进入鸡胚，刺破鸡胚羊膜，将100Rl临床标本注入鸡胚羊膜腔。作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—12然后将针头退出至针头的一半，将另外100Rl临床标本注入鸡胚尿囊腔。5）同一注射器将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。6） 用注射器反复吸取2%。次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器盒中。7） 用胶水或者消毒过的医用胶布封口。8） 鸡胚于35^培养2〜3天。进行病毒分离培养时，每天应检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。6.1.4鸡胚尿囊液和羊水的收获1） 在收获前应4°C过夜或至少放置4小时。2） 标记15ml无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。用70%〜75%酒精消毒鸡胚气室端。3） 用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用10mL无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用移液管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并。4） 收获病毒培养液后的鸡胚在生物安全柜内装入密封袋，然后进行高压处理。5） 将鸡胚收获液3000rpm离心5min去除血液和细胞。进行红细胞凝集试验HA>1:8的进行病毒的鉴定。6） 如没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚传代1次（对于“O”相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）。传代后HA滴度仍为阴性的标本，可以按有关生物安全规定进行处理。对于HA<8的鸡胚分离物继续进行鸡胚传代，直至HA>8时再进行病毒的鉴定。经连续传代后HA<8，可以用RT-PCR方法鉴定分型。鸡胚传代对于HA>8的病毒进行鸡胚病毒传代前应将病毒液进行10-1...10-3稀释。具体的稀释浓度与HA滴度的大小有关。一般滴度小于1:32时选择10-1稀释度接种；滴度大于1:32以上时选择10-2或10-3稀释度接种。6.1.5注意事项1） 不要在-20C条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下甲型H1N1病毒极不稳定。2） 流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。禁止在同一实验室，同一时间接种未知临床标本和已知其他亚型标准病毒。禁止在同一实验室，同一时间接种来自不同动物的标本。动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。病毒分离物的鉴定------血红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验流感病毒的血红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验室生物安全级别：缓冲液和其它液体试剂、作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—12红细胞悬液的配制可在BSL-1以上（含BSL-1）实验室进行。血清处理、血凝实验、血抑实验应在BSL-2中进行，实验操作人员需进行BSL-2防护。血凝实验、血抑实验操作必须在上述级别实验室的生物安全柜中进行。7.1实验材料及试剂配制7.1.1国家流感中心提供的流感病毒标准参照抗原与血清流感病毒HA抗原：季节性H1N1、季节性H3N2、乙型Yamagata-系、乙型Victoria-系、新甲型H1N1、其他型别流感病毒液流感病毒HAI抗血清：季节性H1N1、季节性H3N2、乙型Yamagata-系、乙型Victoria-系、新甲型H1N1、其他型别流感病毒抗血清7.1.2缓冲液和其他液体试剂1） 磷酸缓冲液（PBS），PH7.425XPBS缓冲液：2.74gNa2HPO4,0.79gNaH2PO4加去离子水至100ml。工作液：25XPBS缓冲液完全溶解后，取40ml25倍PBS液，加入8.5gNaCl,加去离子至1000ml。用1NNaOH或1NHCl调整PH至7.4。高压灭菌15分钟，至4°C保存，保存期为3周。2） 生理盐水，0.85%NaCl20X母液：170gNaCl加入1000ml去离子水，高压灭菌。工作液：20X母液50ml加入去离子水950ml。高压灭菌15分钟，至4C保存，保存期为3周。3） 阿氏液Alsever液葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、NaCl0.42g、柠檬酸0.055g，加去离子水100ml，微热溶解后，过滤，8磅20分钟灭菌，4C储存备用。4） 红细胞悬液配制a.取阿氏液中的红细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清。^加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，1200rpm离心5分钟，弃上清。PBS液体洗涤三次。最后一次洗涤后，1200rpm离心10分钟。将红细胞稀释至合适的浓度。如用鸡、火鸡的红细胞，工作液浓度为1%（体积比）如用人“O”型、豚鼠红细胞，工作浓度为1.5%（体积比）。7.1.3其他离心管、无菌纱布作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—1237°C水浴、56°C水浴台式离心机、多道可调加样器、单道加样器96孔微量板：鸡/火鸡红细胞最好用“V”底板，也可用“U”底板;豚鼠和人“O”型红细胞必须用“U”底板。表1流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞鸡火鸡豚鼠人“O”型血终浓度0.50.50.750.75孔底部形V型V型U型U型孵育时间30min30min45min60min细胞对照细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状7.2血清的处理7.2.1去除血清中的非特异性抑制素动物血清中常存在菲特异性血凝抑制物质，可以造成假阳性结果。去除血清中非特异性抑制物质的方法很多，此处仅列出受体破坏酶（RDE）的去除方法：1） 1份血清加入4份RDE,37C水浴过夜（16-18小时）。2） 56C水浴加热30-50分钟，灭活RDE。3） 加入15倍体积的生理盐水，此时血清稀释度为1：20。置4C保存待用，请勿冻存。7.2.2去除血清中的非特异性凝集素血清中常有一些非特异性凝集素存在使红细胞凝集，去除非特异性凝集素的方法：1体积的红细胞（未经稀释的浓红细胞）可以去除20倍体积的RDE处理过的血清，红细胞与血清混匀后，置室温1h或4C过夜，1000rpm离心5min后取上清。对人血清抗体测定时，一般均经此步处理。7.3待检病毒红细胞凝集试验（HA）滴度的测定将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1〜H1称为第一列；平行方向称行，如A1〜A12称为A行。标记好加样顺序。作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—121 2 3 4 5 6 7 8 91011121）微量血凝板的第2-12列加入50U1PBS。2）在第一列（A1-G1）中加入100史病毒悬液。3） H1加100U1PBS，作为红细胞阴性对照。4） 从第一列各孔吸50U1病毒液，由第一列至第12列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50U1。5） 每孔加入50U1红细胞悬液，轻弹血凝板，充分混匀。6）室温孵育，禽红细胞静置30min；豚鼠红细胞静置45min；人“0”型红细胞静置60min，观察结果并记录。7.4HA试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集以“+”记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。7.5制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原1） 一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。2） 制备4个单位血凝抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25U1抗原，那么测定一份血清须0.2ml抗原。根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制4单位标准血凝抗原。3） 其次，计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以8,得到的商即为4个血凝单位的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。1：8（1ml病毒液加7m1PBS）稀释该病毒即可得到4个血凝单位。作业指导书编号：TYCDCQTD0C0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—12注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25Ul病毒液中含有4个血凝单位（等于50Ul病毒液中含有8个血凝单位）。7.64个血凝单位抗原的复核滴定为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个血凝单位抗原须复核滴定，操作。法参见HA实验步骤。如果有前5孔出现凝集，表明每50Ul病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第6孔也出现凝集，说明每50Ul病毒含有16个血凝单位，该抗原必须等量稀释。如只有前4孔凝集，表明每50Ul病毒仅含有4个血凝单位，病毒量须加倍。此外，4个血凝单位抗原必须每次用前新配制。7.7红细胞凝集抑制试验（HAI）鉴定未知病毒7.7.1在血凝板的B1至H11，每孔加入25UlPBS。在A1-A5、A7-A11分别加入抗季节性H1N1流感病毒标准参考血清、抗季节性H3N2流感病毒标准参考血清、抗乙型Yamagata-系流感病毒标准参考血清、抗乙型Victoria-系流感病毒标准参考血清、抗新H1N1流感病毒标准参考血清50Ul，A6加入PBS作为阴性对照。用多道加样器从A行分别取25Ul血清，由A行至H做2倍系列稀释血清，至最后一行弃去25Ul。A1至H5每孔加入25Ul待检病毒液（4个血凝单位）。第7列至第11列分别加入4个血凝单位的季节性H1N1流感病毒标准参考抗原、季节性H3N2流感病毒标准参考抗原、乙型Yamagata-系流感病毒标准参考抗原、乙型Victoria-系流感病毒标准参考抗原、新H1N1流感病毒标准参考抗原，每孔25Ul。对照孔加入25UlPBS。混匀，室温孵育30min。注：如需鉴定疑似其它型别流感病毒液，在具备相应型别的标准抗原和抗血清的条件下，可根据实际情况，将上述步骤中某一型别