传染病-实习报告

PAGEPAGE１实习报告学院:动物医学院课程:兽医传染病学实习班级:动医10*班学号:171102**姓名:**导教师:王先炜职称:副教授实习时间2013年5月26日至2013年5月31日实习地点逸夫楼40172013年6月南京农业大学教务处制病毒细胞接种1显微镜观察母细胞的生长状态：在显微镜下观察母细胞的生长密度和生长状况。细胞接种：在细胞板中加入过滤后的组织上清液，使其铺满细胞表面，置于37℃二氧化碳培养箱孵育1h；弃去组织滤液，在细胞中加入细胞维持液，37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞生长情况和有无病变。RNA的提取取100ul分离病毒液，加入1mlTrizol试剂，匀浆，室温静置2-3min；加入200ul氯仿，剧烈震荡，室温静置2-3min；4℃12000rpm离心15min；取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10min；4℃12000rpm离心10min；弃上清，加入1.0ml75%乙醇，振摇，4℃12000rpm离心5min；弃上清，干燥沉淀物（室温约5min）；加入20ulDEPC水溶解沉淀。（四）RT-PCR（鉴别高致病性和非高致病性毒株）上游引物：5'-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3'下游引物：5'-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3'PCR反应体系（总体系为25ul)模板4ul（上述RNA提取备用液）10*Mg2+freebutter2.5ul2.5mmol•L-1Mg2+2.0ul25mmol•L-1Mg2+1.0ul20pmol•L-1Dnsp11610.5ul20pmol•L-1Dnsp19280.5ulTaqDNA聚合物0.3ul灭菌双蒸水14.2ul反应循环参数为：94℃3min，48℃45s，72℃75s，进行5个循环；然后94℃1min，54℃45s，72℃75s，进行34个循环；72℃延伸10min。取8.0ul的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。日期：2014.5.28星期：星期四晚上6:00——9:30（一）细菌学实验实验材料：生化反应管：商品化的葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麦芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶生化反应管。商品化试剂：药敏试纸、PCR试剂、引物、琼脂糖细菌：商品化金黄色葡萄球菌2.细菌的生化试验用接种针（无菌）取分离的细菌24h纯培养物分别接种到含葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麦芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶的生化反应管中，开口向下，放到灭菌培养基中，37℃培养24h，观察结果并记录。同时进行脲酶试验、氧化酶试验和接触酶试验。（1）糖类分解试验原理：接种细菌若发酵某种糖或醇，可产酸，使培养液颜色由紫色变为黄色；如发酵的同时又产生气体，培养液颜色由紫色变为黄色的同时，在微量发酵管顶部积有气泡。 结果判定：接种后24h观察结果。产酸，培养液颜色由紫色变为黄色；产酸产气，培养液颜色由紫色变为黄色，并在微量发酵管顶部积有气泡。（2）脲酶试验原理：细菌分解尿素产生两分子氨，培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。 接种方法及结果判定：用接种环将细菌培养物接种与尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。1～6h观察，有时需要24h到6d。阳性反应，则琼脂斜面有粉红到紫红色。阴性反应，不变色。氧化酶试验原理：氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。接种方法及结果判定：取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。（4）接触酶试验（也叫做触媒实验或者过氧化氢酶实验） 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。接种方法及结果判定：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。（5）硫化氢试验原理：细菌分解含硫氨基酸，产生硫化氢，与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁发生反应，形成黑色的硫化氢或硫化亚铁。结果判定：接种后24h观察结果，培养液变黑为阳性，不变色为阴性3.药敏试验药敏试纸种类：头孢喹肟、头孢曲松、阿米卡星、青霉素G、氨苄西林、头孢唑林、诺氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、阿奇霉素、庆大霉素、新霉素、氯霉素、红霉素、林可霉素、复方新诺明。用涂布棒将分离细菌涂布与TSA或鲜血平板上，将各种抗菌药物圆纸片（任选7种）分别贴于培养基表面，各片距离要相等，37℃培养，培养24h检查。结果判定：根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断对药物的敏感程度。无抑菌圈，细菌对该抗生素不敏感；抑菌圈小于10mm，对该抗生素低度敏感。细菌在血平板上的初步鉴定将副猪嗜血杆菌水平划线接种鲜血琼脂平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24-48h，呈现出典型的“卫星生长”现象，并且不出现溶血。DNA提取取适量菌液（1/3EP管），12000rpm、5-6min，弃上清；加400ulTE溶液重悬细菌，离心12000rpm、5-6min；弃上清，加400ulTris（0.1mTris、8.5PH）重悬；加6ul蛋白酶K，56℃水浴30-45min；100℃煮沸20min，-20℃保存备用；DNA的PCR检测引物HSP1：GTGATGAGGAAGGGTGGTGTHSP2：GGCTTCGTCACCCTCTGTPCR反应体系（总体系为25ul)模板3ul（上述DNA提取备用液）10*Mg2+freebutter2.5ul2.5mmol•L-1Mg2+2.0ul25mmol•L-1Mg2+1.0ul20pmol•L-1Dnsp11610.5ul20pmol•L-1Dnsp19280.5ulTaqDNA聚合物0.3ul灭菌双蒸水15.2ul反应循环参数为：94℃3min，48℃45s，72℃75s，进行5个循环；然后94℃1min，54℃45s，72℃75s，进行34个循环；72℃延伸10min。观察病毒液接种的细胞，是否有细胞病变日期：2014.5.30星期：星期五晚上注：因为农场主母亲去世，不能按照原先计划参观江浦农场，故先将周六晚上的实验计划提前到周五晚上。DNA的PCR琼脂糖凝胶电泳和RNA的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳取8.0ul的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，二者操作相同。老师小结关于本次实习的总结。包括操作中的注意事项及需要纠正的操作方法，如何分析实验结果，不同实验的失败原因分析思路及实习报告的写法等。四、实习结果及分析触片检查肺部组织触片和支气管触片观察到少量两极革兰氏阴性染色短小杆，还观察到一些长杆菌和小球菌。增殖和镜检TBS管均浑浊，有菌生长。镜检有两极革兰氏阴性染色短小杆菌。卫星试验待检和阳性对照两块血平板均无明显的卫星生长现象。生化试验试验项目待检组标准组结果分析糖类分解葡萄糖+++可能待检样品和阳性标准样品还是被污染了，所得结果有一定相似性却并不完全一致，也有可能是在接种过程中接种针温度过高使样品菌受损所致。蔗糖+-eq\o\ac(○,+)果糖-++半乳糖-++D-核糖+-+麦芽糖--+硫化氢乙胺酰胺鸟氨酸脲酶试验注：“＋”表示产酸；“○”表示产气；“eq\o\ac(○,+)”表示既产酸又产气；“－”表示不产酸也不产气。药敏试验标准菌共做3块板，16种药物，仅两块板有针尖大小透明菌落生长；待检菌共做两块板，12种药物，均无菌落生长。记录为标准菌组中有效抑菌圈，其中红霉素和复方新诺明的为平均值。药物抑菌圈半径结果结果分析阿米卡星12mm敏感所做待检样品菌对七种抗生素均敏感程度与副猪嗜血杆菌基本相同。红霉素8mm不敏感氯霉素19mm敏感新霉素12mm敏感头孢唑啉21mm敏感林可霉素7mm不敏感复方新诺明10mm敏感阿奇霉素15mm敏感排序：头孢唑啉>氯霉素>阿奇霉素>新霉素=阿米卡星>复方新诺明>红霉素>林可霉素RT-PCR（RNA病毒）和PCR（DNA病毒）RT-PCR和PCR产物的电泳图像中均无HPS阳性条带，可判断没有病毒。RT-PCR和PCR电泳结果图（7）细胞病变情况①正常细胞，细胞大小基本相等，均匀平铺生长（图一）；②接毒24h后有出现细胞病变，部分细胞聚集成团块状（图二）；③接毒48h后细胞聚集成团块状，相较于第二天聚集更明显，因为一般要盲传三代才可出现明显的CPE，此次实验一代在显微镜下已有病变，因此可确认有病毒增殖（图三）。图一图二图三五、讨论实验无菌意识不足：应在酒精灯15cm范围内操作，不可将平板盖子完全打开接种，要注意规范操作，取用无菌实验物品，勿碰触枪头尖头部或是容器瓶口等。触片：制作触片时,沾一下即可，不要涂布，在开放环境下即可进行操作。涂片：涂片操作时，先滴加生理盐水，生理盐水要适量，涂布均匀后在酒精灯上间断过几下，不可太烫，以不烫手背为原则。染色：HE染色时需注意每一步的染色时间，用蒸馏水冲洗时要将载玻片倾斜，从一头缓缓冲洗，以防将样品洗脱，每次加试剂时要完全覆盖样品表面，使其充分染色。倒平板：需注意要灼烧瓶口，倒15-20ml琼脂，在酒精灯无菌范围内操作，平板开口不要太大，以免细菌污染。本次实习过程中很多制作好的平板第二天就长了杂菌，证明大家的无菌操作还是不够规范。油镜：使用前后都要用二甲苯涂抹擦镜纸将油镜擦干净，以免影响下次使用。细菌划线接种：要先将平板周围在酒精灯外焰下烧一圈，然后左手抓紧TSA平板，用手掌将平皿的底固定，用拇指和食指将平皿的盖略抬起一些，然后右手持接种环，接种环也要先烧一下，然后接触病料，再与平板平面呈30°轻轻划线，一定要利用腕力，避免将平板划破，划线时尽量靠近酒精灯；接种环灼烧消毒后要冷却后再接种。蓝耳病毒的细胞病变是形成空斑，但不是所有的病毒病变都一样，也有形成合胞体胞浆颗粒化或产生轻微病变等等，在临床试验中注意区别，真正判定病毒种类还是得做PCR检测。细胞脱落原因：孵育的时间太长；实验过程中过度摇动；细胞老化；没有在CO2培养箱培养；有细菌污染。判定细胞污染：细胞营养液浑浊（对光有颗粒非污染）支原体污染：营养液变黄营养液没有超过1/10提取RNA后要立即进行反转录操作，如果不立即实验，需-70℃保存材料。做DNA的PCR加样时，需在正常环境下进行，不可有风，否则影响结果（在本次试验中因为重点在于熟悉操作，同学太多加上天气炎热故没有关闭风扇）。原定于周五参观江浦农场的计划最终改为下周二（6月10日）参观。自我鉴定：经过本次实习，我不但了解了整个传染病的诊断流程，也对不同实验室检测手法有了一定的认识，基本掌握了一些常用实验室诊断试验的操作方法及注意事项。综合近几年学习的相关试验方法，对传染病的诊断有了系统的认知和理论的融合。同时在此过程