家族性淀粉样多发性神经性损害转甲状腺素蛋白的化学修饰

家族性淀粉样多发性神经性损害转甲状腺素蛋白的化学修饰【摘要】目的：建立一种分析血浆脂蛋白存有转甲状腺素蛋白化学修饰的方法.方法：利用PCR方法诊断家族性多发性神经性损害患者基因突变位点.密度梯度超速离心法分离正常健康人和FAP患者血浆脂蛋白.利用水晶震荡子分子之间亲和仪，分析TTR蛋白与脂蛋白之间分子亲和性.ELISA方法测定血浆脂蛋白TTR浓度.用MALDITOFMS方法比较血浆与脂蛋白含有TTR蛋白的化学修饰程度.结果：PCR方法诊断FAP患者TTR蛋白基因突变位点.分析正常人血清TTR与脂蛋白具有亲和性；正常人血浆脂蛋白TTR蛋白含有TTR浓度与FAP患者之间无明显差别.FAPATTRVal30Met杂合子患者血浆以及脂蛋白中含有TTR蛋白，分子质量发现4个主要TTR蛋白峰.结论：MALDITOFMS方法能够分析血浆、血浆脂蛋白中含有TTR蛋白的化学修饰.

【关键词】脂蛋白类；转甲状腺素蛋白；淀粉样神经性病，家族性；化学修饰

【Abstract】AIM:Toestablishamethodforanalysisoftransthyretin(TTR)modificationinplasma.METHODS：TTRgenemutationwasidentifiedinfamilialamyloidoticpolyneuropathy(FAP)patientsusingPCRandplasmalipoproteinwasisolatedfrombothFAPVal30Metpatientsandhealthyvolunteersusingdensitygradientcentrifugation.AffinitybetweenTTRandplasmalipoproteinwasanalyzedbyquartzcrystalmicrobalance(QCM).SerumTTRlevelwasmeasuredinbothFAPpatientsandhealthyvolunteers.TTRmodificationratiobetweenserumTTRandlipoproteinTTRwascalculatedinFAPpatientsusingMALDITOFMStesting.RESULTS：TheserumTTRhadanaffinitywithplasmalipoproteininhealthyvolunteers.AndthelevelsofserumTTRwerenotsignificantlydifferentbetweenFAPpatientsandhealthyvolunteers.Inbothserumandlipoprotein,TTRwasfoundtohavefourdifferenttypesofmodificationinFAPVal30Metpatients.CONCLUSION：MALDITOFMScanbeusedinidentifyingTTRmodification.

【Keywords】lipoproteins；transthyretin；amyloidneuropathies,familial；chemicalmodification

0引言

转甲状腺素(transthyretin，TTR)蛋白由127个氨基酸组成，在生理条件下4个TTR蛋白单体分子结合一个T4单体分子形成聚合体，存在于血液中参与甲状腺素的转运［1］.TTR蛋白基因发生遗传性突变以及在其他因素作用下TTR蛋白聚合体不稳定，容易分离形成单体.立体结构发生变化的TTR单体，进一步重合形成蛋白纤维沉积于全身组织、脏器的细胞间质，引起末梢神经、自主神经感觉障碍以及全身症状为特征的综合临床症状，称为家族性多发性神经性损害(familialamyloidoticpolyneuropathy，FAP)［2-3］.我们建立一种能够分析血浆、尿液、血浆脂蛋白含有TTR蛋白化学修饰的方法，为研究化学修饰与淀粉样沉积形成提供方法保障.

1材料和方法

材料

健康正常人8例，FAP患者7例，符合诊断标准，经PCR确定为ATTRVal30Met遗传基因突变杂和子.血浆脂蛋白分离试剂：d=:NaClg，EDTA·Na2g溶于DH2O500mL中，然后加入1mol/LNaOH1mL，最后调至1000mL.d=:上述d=溶液100mL中加入BrNag.d=:d=溶液100mL中加入BrNag.d=:d=溶液和d=溶液，以2∶1比例混合.d=:将d=溶液和d=溶液以2∶1比例混合.ELISA洗净液.标本稀释液(Na2CO3g,NaHCO3g)/L,抗体稀释液：gelatin/洗净液.封闭液：gelatin500mg/标本稀释液100mL.

方法

FAPATTRVal30Met杂合子患者7例，健康正常人8例，摄入奶酪20g,3h静脉采血分离脂蛋白，血浆4mL中加入d=溶液2mL，48000g离心18h.收集CM/VLDL部分.下层与d=溶液2mL混合，上层加入d=mL，190000g离心20h，收集上部LDL3mL.下层加入d=溶液2mL，然后与d=溶液1mL形成层，190000g离心40h，收集上层2mL.水晶振荡子分子之间亲和性分析仪，测定TTR与脂蛋白之间的亲和性.分别将2μgWTTTR和ATTRVal30Met固定于水晶振荡子上，然后将该振荡子浸入6mL磷酸缓冲液中平衡后，分别将15μL各种脂蛋白加入不同的水晶振荡子上，同时记录脂蛋白与TTR结合的速率信号［4］.TTR浓度的测定：96孔酶标反应板，每孔加入100μL抗血清TTR抗体反应12h，洗涤3次，然后加入封闭液250μL，作用1h.洗涤3次，加入稀释标本100μL，反映1h，洗涤3次.加入100μL抗人血清TTR抗体反应1h.洗涤后再加入HRP标记抗体100μL，反应1h.最后加入基质液100μL10min后，用405nm波长进行测定TTR蛋白浓度.另质量分析装置测定TTR蛋白的修饰性：在标本100μL中加入抗人血清TTR抗体25μL，4℃作用24h9000g离心5min沉降物，分别用生理盐水和重蒸馏水各洗涤2次，最后使TTR蛋白与相应抗体分离，提取所需TTR蛋白［5］.

2结果

蛋白与血浆脂蛋白分子之间亲和性健康正常人血清提取WTTR蛋白以及血浆提取各种脂蛋白.利用水晶震荡子分子之间亲和性分析仪测定TTR蛋白与脂蛋白之间的亲和性，TTR与CM/VLDL亲和性以及结合量最强，其次为HDL，最低为LDL.

血浆脂蛋白中TTR蛋白含量利用血清WTTR为标准，ELISA方法分别测定血浆、脂蛋白中TTR浓度.正常人以及FAPATTRVal30Met患者空腹以及摄入20g奶油后，各种脂蛋白中TTR含量以CM/VLDL为高，其次为HDL，最低为LDL.

ATTRVal30Met患者血浆与脂蛋白间TTR蛋白的化学修饰利用抗原

抗体免疫结合沉淀方法分离TTR蛋白，血浆TTR蛋白出现四个主要TTR蛋白高峰.与标准蛋白Marker作参照分别为WTTR(a)ATTRVal30Met(b);WTTRCystinATTR(a′)Val30MetCystin(b′);血浆脂蛋白TTR分子质量分析结果与血浆相似，出现4个主要TTR蛋白峰值.

3讨论

利用ELISA方法证明血浆脂蛋白存有TTR蛋白；利用抗原抗体特特异性结合原理，免疫沉淀方法提取血清、血浆脂蛋白中TTR蛋白，结合MALDI/TOFMS方法能够测定TTR蛋白的化学修饰.MALDITOFMS分析方法为在真空条件下，分子基团飞行程度与分子量相关.该方法能够精确分析分子质量，在鉴别蛋白、多肽等大分子质量等方面已经被广泛应用相关学科的研究.TTR蛋白的化学修饰，在淀粉样沉积形成方面引起学者的关注.利用水晶震荡子分子之间亲和性分析仪，分析血浆脂蛋白与正常血清TTR蛋白分子之间亲和性，发现TTR蛋白能够与血浆脂蛋白亲和曲线为抛物线，逐渐达到最大结合点后保持平衡.利用ELISA法实验结果发现脂蛋白与TTR抗体免疫反应程度明显增加.ELISA方法测定健康正常人、FAPATTRVal30Met患者，血浆脂蛋白中存有TTR蛋白浓度.比较正常健康人组与FAPVal30Met患者组血浆脂蛋白中存有TTR蛋白含量，两组之间未发现有明显差别.

探讨加入适量特异性抗体量以及抗原抗体比例，提取抗原抗体免疫复合物成分，经过相应方法处理，MALDITOFMS分析TTR蛋白的分子质量，在血浆、血浆脂蛋白组分中均出现反应性高峰，提示该方法能够测定TTR蛋白.同时血浆与血浆脂蛋白中TTR蛋白均出现相同分子量高峰相同，提示该方法处理能够提取纯净TTR蛋白效果良好；比较血浆与脂蛋白中TTR蛋白分子质量的变化，经计算结果提示TTR与cystine结合分子质量相符.最近我们研究中心报道，淀粉样沉积阳性组织内脂蛋白水平明显增加，并且高密度脂蛋白免疫组织化学染色与淀粉样沉积完全重合［6］.结合上述试验结果提示脂蛋白与淀粉样沉积形成可能相关.

【参考文献】

［1］PetterssonT,ErnstromU,GriffithsW,etal.Luteinassociatedwithatransthyretinindicatescarotenoidderivationandnovelmultiplicityoftransthyretinligands［J］.FEBSLett,1995,365:23-26.

［2］TakaokaY,TashiroF,YiS,etal.ComparisonofamyloiddepositionintwolinesoftransgenicmousethatmodelfamilialamyloidoticpolyneuropathytypeⅠ［J］.TransgenicRes,1997,6:261-269.

［3］AndoY,NyhlinN,SuhrO,etal.Oxidativestressisfoundinamyloiddepositsinsystemicamyloidosis［J］.BiochemBiophysResCommun,1997,232:497-502.

［4］Okahata,OkahataY,EbatoH.Absorptionbehaviorsofsurfactantmoleculesonalipidcoatedquartzcrystalmicrobalance.Analternativetoeyeirritanttests［J］.AnalChem,1991,63:203-207.

［5］AndoY,OhlssonPI,SuhrO,etal.Anewsimplerapidscreening