Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术

Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术范围本标准规定了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测鸡血清4型Ⅰ群禽腺病毒抗体的技术规范。本标准所规定间接酶联免疫吸附试验（ELISA）适用于鸡血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染抗体的特异性检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫术语和定义下列术语和定义适用于本文件。血清4型Ⅰ群禽腺病毒FowladenovirusgroupⅠSerotype4是引起鸡心包积水-肝炎综合征的病原，主要造成3周龄～5周龄鸡突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎。一抗Primaryantibodies第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。本标准的一抗为经离心后分离后鸡的血清待检样品。酶标二抗HRP-labeledsecondaryantibodies二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白，同时用辣根过氧化物酶进行标记的抗体。本标准中的酶标二抗为兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的IgG，其效价应在1:32以上。血清标准品SPF鸡接种血清4型Ⅰ群禽腺病毒经PCR检测为阳性后，制备的血清为阳性血清；SPF鸡的血清作为标准阴性血清，PCR检测结果为阴性。实验室要求环境实验室符合GB19489和GB/T27401要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品（血液）收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理和血清学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理以及熟悉间接ELISA检测结果的判断方法。仪器设备台式高速离心机（最大转速为15000rpm）。酶标仪。微量移液器：最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL。聚苯乙烯板。水平振荡器。恒温培养箱。试剂或材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T6682规定的一级水。阳性血清，SPF鸡接种血清4型I群禽腺病毒经PCR检测为阳性后，制备的血清。阴性血清，SPF鸡血清，PCR检测结果应为阴性。血清4型I群禽腺病毒抗原：经浓缩纯化灭活后的全病毒，浓度为4.68mg/mL。酶标二抗：兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的IgG，效价应在1:32以上。磷酸盐缓冲液（PBS），见附录A.1。包被液，见附录A.2。洗涤液，见附录A.3。样品稀释液（封闭液），见附录A.4。底物溶液，TMB底物显色液。终止液（浓度为2M），见附录A.5。样品样品的准备与处理待检禽血清样品，每份不少于200µL，无溶血。用样品稀释液4.4.8将被检血清样品稀释10倍（1:10，如10µL血清加入90µL稀释液中）。注意：不要稀释对照血清。确保每个样品换一个吸头，做好样品的标记。稀释的样品血清充分混匀后，加入包被孔。样品保存样品应尽快处理。操作步骤将试验试剂预温到20℃～25℃。将全病毒抗原按照浓度为4.68μg/μL用1×碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释400倍，每孔100μL加入到96孔聚苯乙烯板中，37℃孵育2h后，继续4℃孵育过夜。孵育后洗涤液洗5次，甩干板上残余液体。每孔加入200μL封闭液，37℃温箱孵育1h，用5.3.2方法洗板。在A1、A2孔各加100µL阴性血清对照，A3、A4孔各加100µL阳性血清对照。将100µL稀释好的待检血清加入其他各孔，混匀后，37℃孵育1h，用5.3.2方法洗板。酶标二抗用样品稀释液按1:1000倍稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用5.3.2方法洗板。每孔加入100μLTMB显色液，37℃避光条件下孵育15min。每孔加入50μL终止液，轻轻振荡，终止反应。将酶标板置于酶标仪中，于450nm测定各孔样品的吸光值（OD），该操作需在30min内完成。结果判定阴性对照OD均值=（ODA1+ODA2）/2；阳性对照OD均值=（ODA3+ODA4）/2。阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.40；阴性对照平均值必须小于等于0.36，试验条件成立，否则重复测定。阳性样品OD450≥0.40，待检血清为阳性，即已感染血清4型I群禽腺病毒。阴性样品OD450＜0.36，待检血清为阴性，即未感染血清4型I群禽腺病毒。可疑样品0.36＜OD450＜0.40，判为可疑，重复测定。

（规范性附录）

ELISA试验用溶液的配制磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/LpH7.4）NaCl8.0gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O0.2g水加至1000mL包被液（0.05mol/LpH9.6）Na2CO30.2