猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程

猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程范围本文件规定了猕猴桃溃疡病PCR检测技术规程的术语和定义、缩略语、原理、样品采集、猕猴桃溃疡病分子鉴定（PCR）、结果判定、检测后样品的处理。本文件适用于对猕猴桃属植物感染猕猴桃溃疡病的检验、检测和鉴定。规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

猕猴桃溃疡病bacterialcankerdiseaseofkiwifruit由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonasyringaepv.actinidiae）引起，主要通过苗木、接X和花粉远距离传播，有时带菌土壤亦能传病，已经成为制约猕猴桃产业发展最严重的病害。缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对DNA：脱氧核糖核酸PCR：聚合酶链式反应Taq酶：TaqDNA聚合酶EB：溴化乙锭Tris：三羟甲基氨基甲烷EDTA：乙二胺四乙酸CTAB：十六烷基三甲基溴化铵PVP：聚乙烯吡咯烷酮原理猕猴桃溃疡病，在鉴定时除了进行田间识别外，主要采取细菌DNA体外扩增的方式进行检测。根据猕猴桃溃疡病基因组序列设计一对特异性引物，在热稳定DNA聚合酶的作用下，合成大量目标DNA片段，最终通过凝胶电泳分离检测出特定大小的猕猴桃溃疡病菌特异性DNA谱带，根据该谱带的有无确定样品是否带有猕猴桃溃疡病菌。样品采集鉴定取样采有典型和疑似症状的植株叶片（参见附录A.1），树苗每株采5张叶片，大树每株采20张叶片，样品保存于可密封熟料袋中，同时在密封袋中放入一小团用手拧干的湿纸巾，冰块冷藏运输，3d内送实验室检测；采有典型和疑似症状的植株枝干样品（参见附录A.2），10cm长一段，共3段，采集样品表面用70%酒精消毒后，装入可密封塑料袋中，同时在密封袋中放入一小团用手拧干的湿纸巾，冰块冷藏运输，3d内送实验室检验。检测取样采取Z字型五点取样法，每个点选取3株，每株分XXXX四个方位采集叶片，树苗每方向采1张叶片，大树每方向采5张叶片，样品保存于可密封熟料袋中，同时在密封袋中放入一小团用手拧干的湿纸巾，冰块冷藏运输，3d内送实验室检测；采植株枝干样品10cm长一段，共3段，样品保存于可密封熟料袋中，同时在密封袋中放入一小团用手拧干的湿纸巾，冰块冷藏运输，3d内送实验室检测；从同一株树上采集的所有叶片或枝干为一个样品，样品保湿后装入可密封塑料袋中，2d内送实验室检验。猕猴桃溃疡病菌分子鉴定（PCR）试剂及要求要求除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用高压灭菌的无菌容器分装。试剂PCR检测需要以下主要试剂：无菌超纯水ddH2OPCR缓冲液[×10，含15mMMg2+]特异性引物对[10µM]dNTPs[2.5mMeach]Taq酶[5U/µL]100bp梯度DNA标准分子量X脂糖DNA提取液（含2.5%PVP）（按附录B配制）DNA提取液（不含PVP）（按附录B配制）裂解缓冲液（按附录B配制）5%十二烷基肌氨酸钠溶液（按附录B配制）氯仿﹕异戊醇混合液（按附录B配制）酚﹕氯仿﹕异戊醇混合液（按附录B配制）上样染料（按附录B配制）EB（按附录B配制）10×TBE电泳缓冲液（按附录B配制）仪器和用品用具PCR检测需要以下主要仪器设备和用品：PCR扩增仪分光光度计水平电泳仪高速台式冷冻离心机，转速在14000rpm以上凝胶成像系统微量移液器一套：0.1μL～2.5μL，0.5μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，200μL～1000μL冰箱（4℃和-20℃两种）通风橱水浴锅超纯水仪陶瓷研钵及研杵2mL离心管PCR反应管1mL枪头，200μL枪头，10μL枪头本实验所用塑料枪盒、离心管、PCR反应管、一次性塑料枪头都需经过高压灭菌（121℃，20min）并烘干。试样制备样品存放采集的样品经处理后，在2℃～8℃条件下保存应不超过二周，若需长期保存，应置于-70℃以下，冻融不超过3次。样品预处理将猕猴桃叶片或枝干用流水清洗干净，吸水纸擦干，备用。冲洗废液及用过的吸水纸进行灭活处理。存放的样品处理存放于–70℃超低温冰箱的样品，从低温冰箱中取出时立即放入液氮中。样品DNA提取DNA提取按照以下步骤进行：取2g～3g叶片组织或者枝干组织，剪碎后放入无菌研钵中，加入液氮研磨至粉状；取2mL无菌离心管，加入200mg左右的研碎植物组织，再用含2.5%PVP的DNA提取液加满离心管，涡旋1min～2min，14000rpm离心5min，倒掉上清液；用不含PVP的DNA提取液再加满离心管，重新悬浮，涡旋1min～2min，14000rpm，离心5min，倒掉上清液；加入不含PVP的DNA提取液300μL重新悬浮植物组织，加入300μL裂解缓冲液，200μL5%十二烷基肌氨酸钠溶液，涡旋混匀；65℃水浴45min，水浴期间每隔一段时间进行涡旋一次；加入800μL氯仿﹕异戊醇（24﹕1），轻轻翻转离心管几次混匀，10000rpm5min离心；将上清液转移到一新的无菌2mL离心管中，加入800μL酚﹕氯仿﹕异戊醇（25﹕24﹕1），轻轻翻转离心管混匀，10000rpm5min离心；取上清液到一新的无菌2mL离心管中，加入2.5倍体积的冰冻100%乙醇，1/10体积的醋酸钠，轻轻翻转离心管几次混匀，12000rpm15min离心；倒掉液体，加入1mL冰冻70%乙醇，轻轻翻转离心管几次，12000rpm，5min离心；再次倒掉液体，加入1mL冰冻70%乙醇，轻轻翻转离心管几次，12000rpm，5min离心；倒掉液体，室温下晾干离心管；加入50μL无菌超纯水溶解DNA。DNA检测于1.2%X脂糖凝胶电泳（电压120V）20min～40min，于凝胶成像系统中观察是否有DNA谱带。分光光度计检测D260/D280的比值（OD260/OD280值在1.8～2.0之间认为得到的DNA纯度较高），用无菌超纯水稀释DNA浓度至50ng/µL。PCR检测PCR扩增体系扩增引物序列：正向引物5’-ACCTGGTGAAGTTGGTCAGAGC-3’；反向引物5’-CGCACCCTTCAATCAGGATG-3’；扩增体系见表1，体系总体积25µL/管。表1猕猴桃溃疡病菌PCR扩增体系检测试剂终浓度每管加入量/µL模板DNA2ng/µL1无菌超纯水－17.3dNTPs[2.5mMeach]0.2mMeach2PCR缓冲液[×10]1×2.5正向引物[5µM]0.2μM1反向引物[5µM]0.2μM1Taq酶[5U/µL]1U/25µL0.2总体积－25PCR扩增按表1，依次向PCR反应管中加入超纯水、dNTPs、PCR缓冲液、正向引物、反向引物、Taq酶、模板DNA，低速离心后放入PCR仪，PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃下保存。检测时同时设阴性对照和阳性对照。电泳及成像电泳将PCR产物5µL与上样染料3µL混合，加入1.5%X脂糖凝胶的点样孔中，同时设100bp梯度DNA标准分子量作为片段大小的标准。100V电压电泳约40min。成像及分析将电泳后的X脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内，观察分析并成像保存。结果判定样品PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，凝胶上阳性对照出现一条175bp大小的特异性条带，阴性对照没有该特异性条带；供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品为阳性，即带猕猴桃溃疡病菌；供试样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品为阴性，即不带猕猴桃溃疡病菌。检测后样品的处理DNA提取液放置于-20℃以下，以备复检。用于猕猴桃溃疡病菌检测的植物样品、用具，以及实验操作台面和废液在完成检验后，植物样品集中销毁，用具及废液进行灭活处理，实验操作台面用70%酒精杀菌。

（资料性）

猕猴桃溃疡病症状特征猕猴桃溃疡病叶片症状特征叶片发病时在新生叶片上呈现褪绿小点，水浸状，后发展为1mm～3mm的不规则形或多角形褐色病斑，边缘有明显的淡黄色晕圈，湿度大时病斑湿润并有乳白色菌脓溢出。高温条件下病斑呈红色，在连续阴雨低温条件下，病斑扩展很快，有时也不产生黄色晕圈。叶片上产生的许多小病斑相互融合形成枯斑，叶片边沿向上翻卷，不易脱落；秋季叶片病斑呈暗紫色或暗褐色，容易脱落。花蕾受害后不能张开，变褐枯死；新梢发病后变黑枯死。猕猴桃溃疡病枝干症状特征感病植株最初从发病部位芽眼、叶痕、皮孔、小伤口等处溢出乳白色粘质菌脓，划破皮层可见韧皮部开始变为深灰色腐烂。病部皮层组织逐渐变软呈水浸状下陷，树干或大枝上可出现纵向裂缝。植株进入伤流期后，病部的菌脓与伤流液混合从伤口漫溢出，呈锈红色。病斑扩展绕茎一周后导致发病部以上的枝干坏死，也会向下部扩展导致地上部分枯死或整株死亡。

（规范性）

试剂和溶液配制试剂和配制如下：70%酒精：用新开启的无水乙醇和DEPC处理的灭菌超纯水配制；TES缓冲液：1mmol/LTris-HCl（pH7.5）50mL，0.5mmol/LEDTA（pH8.0）2mL，SDS10g，用DEPC处理的灭菌超纯水定容至500mL，高温灭菌后室温保存；TNE缓冲液：1mmol/LTris-HCl（pH7.5）5mL，NaCl2.925g，0.5mmol/LEDTA（pH8.0）1mL，用DEPC处理的灭菌超纯水定容至500mL，高温灭菌后室温保存；水饱和苯酚：氯仿：异戊醇=25﹕24﹕1（体积比）；上样染料：溴酚蓝0.009g，二甲苯蓝0.009g，甘油6mL，0.5mmol/LpH8.0EDTA1.2mL，无菌超纯水5.6mL；10×TBE：Tris108.0g，EDTA9.3g，硼酸55.0g溶于适量无菌超纯水后，定容至1000mL，调节pH为8.0，高温灭菌后保存备用，使用时配制成1×TBE或0.5×TBE稀释缓冲液；玻璃珠悬浮液：取适量425