基因工程大题模板

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。2基因工程操作的基本步骤是什么?①施工材料的准备,即目的基因、载体、工具酶和受体细胞(宿主)的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。(切)②目的基因与载体DNA的体外重组,形成重组DNA分子。(接)③把重组的DNA分子引入受体细胞,并建立起无性繁殖系。(转和扩④筛选出所需要的无性繁殖系,并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表示。(检)3如何理解基因工程的两个特点?答:基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表示。分子水平的操作包括DNA分离、切割和连接(还有其它一些DNA的修饰等)。由于体外重组DNA的最终目的是要改变生物的遗传性,因此分子水平的操作和细胞水平的表示是基因工程的两个最基本的特点。4基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的?答:大分子质量的DNA会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点,因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的DNA片段,每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时(如图所示),每个片段将插入一个不同的载体分子(如一个质粒)。同样地,当用这些质粒转化宿主细胞时,每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA分子,而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体DNA片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了,此重组DNA分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。5比较遗传工程、基因工程和生物技术。答:遗传工程是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想,在离体条件下,对生物细胞、细胞器、染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作,以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。狭义的遗传工程就是指基因工程。基因工程(geneengineering)又称基因操作(genemanipulation)、重组DNA(recombinantDNA)。基因工程是以分子遗传学理论为基础,以分子生物学和微生物学的现代方法手段,将不同来源的基因(DNA分子),按预先设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能。生物技术又称生物工艺学,生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分,进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等。6说明SangerDNA测序法的原理。答:SangerDNA测序法建立在两个基本原理之上:①核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合;②可延伸的引物必须能提供游离的3’羟基末端,双脱氧核苷酸由于缺少游离的3’羟基末端,因此会终止聚合反应的进行。如果分别用四种双脱氧核苷酸终止反应,则会获得四组长度不同的DNA片段。经过比较所有DNA片段的长度能够得知核苷酸的序列。11当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时,若要进行双酶切,应采取什么措施?为什么?答:注意星号活性;先低盐,后高盐;先低温酶,后高温酶;而且能够直接在换酶前将第一种酶失活,再加第二种酶,否则,易产生星号活性,或使用通用缓冲液。12．何谓限制性物理图谱?答:限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restrictionmapping)。简单地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位,即DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。13什么是细菌的限制—修饰系统(RestrictionModificationSystem,R-Msystem)?答:细菌中有作用于同一DNA的两种酶,即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且,这两种酶作用于同一DNA的相同部位,把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。14细菌的限制—修饰系统有什么意义?答:不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是经过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰,由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰,限制酶就不能进行切割。而外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化,宿主的限制酶经过对该位点的识别来分辨敌我,并将入侵的外来DNA分子降解掉。因此DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。15说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答:基本原则:属名+种名+株名十序号。①首字母:取属名的第一个字母,且斜体大写。第二个字母:取种名的第一个字母,斜体小写。第三个字母:取种名的第二个字母,斜体小写。第四个字母:若有株名,株名则作为第四个字母,用正体。②顺序号:若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I、II、III等,用正体。③所有的限制酶,前面还应带有系统的名称,如限制性核酸内切酶R.HindIII。修饰酶则在前面加上甲基转移酶M,如甲基转移酶M.HindIII。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方,R可被省去。16何谓限制性内切核酸酶的切割频率?答:切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成,假定DNA的碱基组成是均一的,而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的,那么对于任何一种限制酶的切割频率,理论上应为1／4n,n表示该限制酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制酶,其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点(1／44=1／256),识别5个碱基的限制性内切核酸酶,其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点,余类推。18双酶消化法(doubledigest)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理是什么?答:双酶消化法是绘制DNA中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA分子的基础上,再用这两个酶同时或先后消化DNA,根据它们的结果构建物理图谱。17什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素的影响?答:II类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性,可是这种特异性受特定条件的限制,即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件发生改变,限制酶的特异性就会松动,识别的序列和切割都有一些改变。改变后的活性一般称第二活性,而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,因此第二活性又称为星号活性。诱发星号活性的因素有如下几种:①高甘油含量(＞5％,v／v);②限制性内切核酸酶用量过高(＞100U／gDNA);③低离子强度(＜25mmol／L);④高pH(8．0以上);⑤含有有机溶剂,如DMSO、乙醇等;⑥有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等)。19什么是DNA多态性(DNApolymorphism)?答:在正常人群中,各个体DNA分子的某些位点能够发生中性改变,这些改变虽然会使DNA一级结构产生一定变化,但不影响基因的表示,如果这种中性突变在人群中的频率不低于1％,这一现象被称为多态性。DNA多态性本质上是染色体DNA中核苷酸数目或排列顺序的个体差异,这些差异多数为中性突变,不引起表型改变。20什么是限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)?答:当DNA序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时,或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后,其片段长度的改变能够经凝胶电泳区分时,DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析,这种多态性称为限制性片段长度多态性(RFLP)。22何为回文序列?答:回文序列(palindromicsequence)是一段自我互补的序列,即同其互补链一样的序列(两者的阅读方向都是从5’→3,)。根据回文序列的结构可分为:完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全回文序列(如GAATTC),一般是限制性内切核酸酶的识别序列;不完全的回文序(TACCTCCAT,CGTGATA),常是其它蛋白质的结合位点(如阻抑蛋白),在基因表示调控中有重要作用;间断的回文序列(如GGTTXXXAACC,有一段是颠倒的重复),它可使单链的核苷酸有可能在tRNA中所见到的一样,形成发夹环的结构。23DNA连接酶的连接机理是什么?答:DNA连接酶是利用ATP或NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA双链间的缺口形成磷酸二酯键。在连接反应中,首先ATP(NAD+)与DNA连接酶反应,同连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物。其中AMP(腺苷一磷酸)经过一种磷酸酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连。同时释放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸(NMN)。AMP激活DNA一条链的5’-末端磷酸基团,并转移到磷酸基团上,形成DNA-腺苷一磷酸复合物。最后,3’-OH对激活的磷原子作亲核攻击,形成磷酸二酯键,同时释放出AMP。连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时,焦磷酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP作为能源的连接酶中,一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷酸键。29列举质粒载体必须具有的基本条件。答:(1)能独立复制;(2)具有选择标记;(3)有独特的酶切位点;(4)能转化但不扩散。24DNA连接酶的作用特点有哪些?①连接反应需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的-OH,而另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下,才能发挥其连接DNA分子的功能作用,而在末端带有5’-羟基和3’-羟基;5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA片段之间不起连接作用。②连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子;③DNA连接酶不能够连接两条单链的DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。④DNA连接酶只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(Nick),即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口25影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪些?答:1)反应温度:最佳反应温度37℃,但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定,连接黏性末端的最佳温度,一般认为4～20℃比较合适。2)DNA片段末端:不但要考虑反应体系中DNA末端的总浓度,还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA分子的末端有较高的几率与另一DNA分子连接,减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段3:1~1:3。3)连接酶浓度:平末端DNA分子的连接反应,最适酶量大约是1～2单位;而黏末端DNA片段间的连接,在同样的条件下,仅为0.1单位时,便能得到最佳连接效率。28切口平移法制备DNA探针的原理是什么?答:在Mg离子存在时,用低浓度的DNA酶I(DNaseI)处理双链DNA,使之随机产生单链断裂。然后用DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性能够从断裂处的5'端除去一个核苷酸,而其聚合酶活性则将一个单核苷酸添加到断裂处的3'端。随着反应的进行,即5'端核苷酸不断去除,而3'端核苷酸同时掺入,导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动,这种现象称为切口平移。如果在反应体系中加入放射性同位素标记的核苷酸,则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基,产生带标记的DNA分子,用作DNA分子杂交探针。27碱性磷酸酯酶主要有两种,细菌碱性磷酸酯酶(BIP)和小牛肠碱性磷酸酯酶(CIP),二者有什么不同?在基因工程中有什么用途?答:主要差别是CIP在68℃时失活,而BAP在68℃稳定,且耐酚抽提。应用:①dsDNA的5’端脱磷酸,防止DNA的自身连接。可是用CIP处理后,最好将CIP除去,再进行连接反应。②DNA和RNA脱磷酸,然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。30举例说明什么是穿梭载体?答:穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒,有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记,因此,很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。38．质粒制备的基本原理?答:带有质粒的细菌细胞在SDS作用下裂解,并在碱性条件下使DNA变性。调节pH值至中性时,质粒DNA首先复性,而细菌基因组DNA不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体,能够被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA分子可被酒精沉淀或其它方法沉淀纯化出来。26什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?答:Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I,得到的两个片段。其中大片段的分子质量为75kDa,它具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切核酸酶的活性,小片段具有5’→3’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5’引物的5’→3’外切核酸酶活性,因此在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途:(1)修复反应,制备平末端。可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其它方法产生的5’或3’突出端,制备平末端,这样能够使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段经过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸,用这种末端填补的方法能够制备3’端标记的探针。用Klenow酶修复5’突出端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性,是填补反应;而修复3’突出端则是用Klenow酶的3’→5’外切核酸酶的活性,是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3’突出端是不理想的,改用T4DNA聚合酶或其它的酶是更好的选择。(2)标记DNA3’突出端(protrudingend)。该反应分两步进行:先用3’→5’的外切核酸酶活性除去3’突出端,产生3’隐含末端,然后在高浓度的标记底物(32P-dNTP)存在下,使降解3’→5’)作用与聚合(5’→3’)作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacementreaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好,因它的3’→5’的外切核酸酶活性较强。(3)其它的一些用途。包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primerextension)制备单链DNA探针等。31YAC载体具有什么样的?为什么在克隆大片段时,YAC具有优越性?答:(1)功能性DNA序列:①来自于酵母的125bpDNA片段的着丝点序列(CEN4)。②来自酵母的自主复制序列(ARS1),起始在酵母中的DNA复制。③来自酵母的端粒序列,它是(5-TGTGGGTGTGGTG-3)的多拷贝重复,它对染色体的复制和维持是必须的。④在酵母中进行选择的标记基因,URA3(尿嘧啶生物合成基因)和TRP1(色氨酸合成基因)。寄主是这些基因的营养缺陷性,只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活⑤具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC载体一般含有ColE1的ori和氨苄青霉素抗性标记基因,能够在大肠杆菌中复制和繁殖,因此它也是一种穿梭载体。(2)优越性:YAC能够容纳长达上千kb的外源DNA,这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因,在染色体步移中每次允许更大的步移距离,同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。40为什么野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?答:(1)噬菌体DNA没有容载能力,因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的,不能大于基因组的105％,因此要将λ噬菌体改造成载体,必须削减本身的分子大小;(2)野生型的λDNA对于一些常见的酶都有多个识别和切割位点,不便于克隆;(3)没有可供选择的标记;(4)野生型的λ噬菌体具有感染性,因此不够安全。33什么是YAC?YAC克隆载体常出现哪些问题?答:YAC即酵母人工染色体(YeastArtificialChromosome)的缩写,是人工构建的染色体样大容量克隆载体,基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA克隆片段可达到kb。问题有:(1)YAC有嵌合现象,一个YAC中克隆的DNA片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中,嵌合体占克隆总数的10％～60％。(2)YAC内部有重组现象,插入的DNA较大,序列发生重排,导致和原来染色体的序列不一致,重组很难检出。(3)YAC还有缺失现象,影响YAC文库的代表性。(4)YAC结构和酵母天然染色体结构相似,使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。(5)构建好的YAC转化原生质化的酵母菌,转化效率低。(6)建好库后保存方便,但要筛选某个基因时工作量大32由于基因工程是人为改变遗传信息的操作,因此必须注意被操作基因的安全。进行严格地监控对质粒载体的安全是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?答:(1)非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说,都不希望载体能够进行自主传递,也不希望被带动转移。(2)具有条件致死突变,如温度敏感质粒pJC307(ColE1的衍生质粒)在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力,可防止克隆基因扩散,只存在于限定的宿主细胞中。(3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组,因为重组后有可能给宿主带来突变。(4)有较小的宿主范围。34什么是BAC?BAC载体的组成与优缺点有哪些?①细菌人工染色体(BAC)是从大肠杆菌F因子改造构建而来的,能够携带大约300kb的DNA插入片段。②载体具有F因子的复制起始点(oriS),可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。③载体包括有4个维持DNA复制和拷贝数目的基因,repE,parA,parBandparC。④具有一个抗生素选择标记基因,和lacZ’基因。在lacZ’基因中组装有一多克隆位点,便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。⑤插入的DNA片段非常稳定,能够在大肠杆菌细胞中维持数百代,而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。⑥主要缺点是每个细胞中的拷贝数少(1~2个),使得分离和筛选较为困难。35利用pBR322质粒插入失活分离带有外源DNA片段的重组克隆的原理是什么?①外源DNA片段插入在pBR322质粒tetr基因的编码序列内(BamHI)位点,使该基因失活;②体外重组反应混合物转化大肠杆菌ampstets菌株,并涂布在amp琼脂平板上,凡获得了pBR322质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落;③将amp琼脂上的菌落原位影印在tet琼脂平板上生长,对比这两个平板的菌落生长情况,凡在amp平板上能够生长而在tet平板上不能生长的菌落,便是属于带有重组体质粒的转化子克隆;挑出这样的阳性克隆,扩增分离带有外源DNA插入片段的重组体质粒。46分离DNA时,为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖?答:①EDTA是螯合剂,可同Mg2+螯合,使核酸酶失去了作用的辅助因子,而被抑制活性。②蔗糖增加缓冲液的黏度,保护DNA不易断裂。36pUC质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么?答:pUC系列质粒载体是在pBR322质粒载体基础上改造来的,它用lacZ’基因取代了pBR322质粒载体上的tetr基因。lacZ’基因编码β-半乳糖苷酶的N末端1-63个氨基酸(α-肽链)的DNA片段,在lacZ’基因内组入了一个多克隆位点(MCS),但不影响lacZ’基因的功能。pUC载体的宿主(E.coli)携带一个编码β-半乳糖苷酶C端序列的基因片段,它们本身用这个基因片段产生的β-半乳糖苷酶片段是无活性的,但它们能够经过α-互补作用在体内相互弥补,即两部分产物能够结合形成有活性的β-半乳糖苷酶。当pUC质粒引入大肠杆菌中,在含有指示剂X-gal和IPTG的诱导培养基上培养时,菌落成蓝色。如果在MCS插入外源DNA片段(基因),破坏了lacZ’基因的功能(插入失活),不再产生α-肽链,不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶,形成的菌落是无(白)色的。因此,根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应,便能够检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。37自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多,即使是ColE1和pSCl01这两个自然质粒也不尽如人意,一般需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容?答:基本内容包括:(1)删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段;削减载体的分子质量,使载体具有更大的容纳外源片段的能力。(2)加上易于选择或检测的标记。(3)限制性内切核酸酶的酶切位点的改造,便于外源基因插入到载体中的特定位置。(4)加上一些调控元件,有利于克隆基因的表示。(5)安全性改造,限定载体的宿主范围。42λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?答:优点:(1)λ基因组中有1／3的非必须区能够被置换。改造成载体后,克隆的片段较大(可达20kb),而质粒载体的克隆片段只有几个kb;(2)用噬菌体λDNA作为载体,即使不进行体外包装,转染的频率也比质粒转化的效率高,包装后的效率就更高了;(3)λ可经过溶原化反应整合到寄主染色体上,当不需要外源基因大量表示时,可让它以溶原性存在,若要表示,可经过诱导即可进入裂解途径,释放出大量的噬菌体,得到的重组DNA的拷贝数就会很多。缺点:(1)包装比较麻烦,包装率不稳定,购买包装蛋白的费用高;(2)没有质粒的用途广泛。43以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时,为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体?答:改造的置换型噬菌体载体,重组入外源片段之后,总体积不能超过入基因组的105％,不能小于又基因组的75％。以置换型λ噬菌体DNA作为载体,首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。如果没有外源片段,仅是两臂连接,长度短于久基因组的75％,不能被包λ噬菌体颗粒,就不能感染寄主,也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后,总长度超过λ基因组105％后,也不能包入噬菌体颗粒,自然也不能形成噬菌斑。44M13系列载体具有哪些优缺点?答:M13克隆系统具有很多优点:(1)克隆的片段大:M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制,因此容载能力大。有报道,有些噬菌体颗粒能够包装比野生型丝状噬菌体DNA长6～7倍的DNA(插入片段可达40kb)。(2)可直接产生单链DNA,这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链DNA探针都是十分有用的。(3)单链DNA和双链DNA都能够转染宿主,并可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13克隆系列的不足:(1)较大的外源片段插入后,在扩增过程中往往不够稳定。一般说,克隆的片段越大,发生丢失的概率越大。(2)单链载体分子感染的细胞中,往往是单链和双链混杂,分离双链比较麻烦。45黏粒载体具有哪些特点与不足?答:主要特点有:①柯斯质粒是含有λ噬菌体COS位点的质粒载体。柯斯质粒具有质粒的复制子,进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制,而且能够被氯霉素扩增。②具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。③插入片段的消化、连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。④具有λ噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同,重组体像λ载体一样,需体外包装后转染细菌。⑤包装后形成的λ颗粒用来感染大肠杆菌,重组DNA像λDNA一样注入细菌细胞,并以COS位点环化。由于缺乏λ的其它DNA序列,环化DNA在细菌体内以质粒一样维持。⑥简化了筛选。载体体积小,承载外源DNA片段大。如果载体的分子质量在5kb的话,得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性,因为要被成功包装,至少要7个分子的载体自连。尽管如此,也是不能被包装的,因为COS位点太多了。重组体只有达到32-45kb才能有效包装体外包装,这就提供了对重组体的正向选择。⑦对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。⑧感染后形成菌落,而不是噬菌斑。黏粒载体也有如下不足:①如果两个黏粒之间有同源序列,可能会发生重组,结果会使被克隆的片段重排或丢失。②含不同重组DNA片段的菌落生长速度不同,会造成同一个平板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同,会造成文库扩增量的比例失调。③包装过程复杂,包装效率不稳定,代价高。47分离DNA用酚抽提蛋白质时,离心后,为什么蛋白质总是停留在水相和酚相之间?答:酚使蛋白质分子间脱水而变性,变性蛋白的密度比水大,但比酚小,因此停留在中间层。39λ噬菌体DNA被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件?为什么?答:①两个cos位点;②线性DNA;③分子大小在λ噬菌体基因组的75%～105%。48为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂?答:(1)胞内存在很高的核酸酶活性,DNA裸露后,很容易遭到核酸酶的降解。(2)在分离DNA的过程中,要用到一些酸碱等化学试剂,也会使DNA断裂。(3)在DNA的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等,产生的机械张力剪切会使DNA断裂。49在DNA分离过程中,酚一般与氯仿联合使用,即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次,为什么?答:原因是酚和水有一定程度的互溶,因此单独使用酚抽提DNA,最终不能除去酚,残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白质变性剂,它不与水互溶,可是能够同苯酚互溶。这样,酚和氯仿联合使用,就能够带走残留的酚。50何谓简并引物(degenerateprimer)?答:所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列),并充分考虑密码子的简并性而设计的、用于PCR扩增的混合引物群体,这种混合引物之间具有不同的碱基组成,但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性,在这种混合引物中必定有一种引物是能够和该基因的DNA序列精确互补。51简并引物设计的一般原则是什么?答:(1)选择保守区设计简并引物。(2)选择简并性低的氨基酸密码区设计引物。(3)注意密码的偏爱性。(4)使用尽可能短的引物,以降低简并性,最短可用15～20个碱基。(5)由于TaqDNA聚合酶在PCR扩增时容易掺入错误碱基,因此设计的引物,其3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸。52如何用PCR制备突变DNA分子?答:可用PCR进行定点突变(SiteDirectedMutagenesis),即在特定位点引入点突变。该突变能够是碱基替代、插入或者缺失。为了在靶基因特定位点导入突变,在PCR引物设计时,将一条引物设计成与靶序列互补但在预期位点作碱基替换或缺失。在引物中的诱发突变序列应该位于引物的5’端或在引物中间部位,但绝不能位于3’端。诱变引物的3’区域(至少6～10个碱基)必须与靶DNA完全互补以使引物与模板的退火完全而且Taq酶能延伸引物。PCR反应先在低特异性环境下反应5～10个循环以使错配得以发生(即在松弛的温度下),一旦少量的突变模板产生,就能够作为靶序列与引物完全互补。扩增反应的终产物即是所需的含有突变的扩增DNA分子,然后经过克隆和序列分析进行确证。53用PCR技术扩增目的DNA片段时,需要一对特意合成的引物来限定目的片段的扩增区域,试说明引物序列合成应遵循什么样原则。答:1)引物长度一般为15～30个核苷酸。2)引物的碱基尽可能随机,G+C含量一般占45％~55％。Tm＝4(G+C)+2(A+T)3)引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4)两个引物之间不应存在互补序列,特别应避免3’端的互补重叠。5)引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％,引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。6)引物3’端碱基是引发延伸的起点,因此一定要与模板DNA配对。7)引物与模板结合时,引物的5’端最多能够游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。8)引物的5’端能够修饰,如附加限制酶位点,引入突变位点等。56怎样将一个平末端的DNA片段插入到EcoRI的限制位点中去?答:能够化学合成一个连接子(linker),即一段长为lObp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段,然后与待克隆片段两端连接起来,如果用EcoRI切割这种连接片段,就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就能够插入到任何EcoRI的限制性核酸内切酶位55TaqMan定量PCR扩增的原理是什么?答:TaqMan定量PCR使用3个引物,或两个引物和一个特异性探针。两个引物接合到目的DNA上下游,以进行目的DNA的合成。第三个引物,或称探针,是特异合成的一段短的DNA片段,可特异性第接合到一条DNA链中间。探针带有两个修饰基团,5’端荧光报告基团(R)和3’端的荧光淬灭基团(Q),这两个基团由于距离靠近会发生荧光淬灭而检测不到荧光。随着PCR的进行,TaqMan探针接合到目的DNA序列上,而且被具有外切酶活性的TaqDNA酶逐个切除而降解。被切下来的荧光基团(R)解除了荧光淬灭的束缚,会在激发光下发出荧光,因此所产生的荧光强度直接反应了扩增靶DNA的总量。54PCR技术体外扩增DNA分子的基本原理是什么?答:PCR是在试管中进行的DNA复制反应,基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理,以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链能够互相转变的性质,人为地控制体外合成系统的温度,以促使双链DNA变成单链,单链DNA与人工合成的引物退火,然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是经过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成,即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环,此循环的重复进行,就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性:模板双链DNA单链DNA,94℃。退火:引物＋单链DNA杂交链,引物的Tm值。引物的延伸:温度至70℃左右,TaqDNA聚合酶以４种dNTP为原料,以目的DNA为模板,催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应,形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR,就是如此重复循环,使目的DNA得到高效快速扩增。57构建基因组文库时为什么要对基因组DNA进行部分酶切?(列举至少两条理由)答:①部分酶切可获得长度适宜的片段(如获得中等长度的酶切片段);②部分酶切可保证切出的DNA片段内部依然保留了部分限制酶位点,便于后续的克隆分析。58什么是基因组文库(genomiclibrary)?它同遗传学上的基因库有什么不同?答:基因组文库是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。包括下列过程:高分子质量染色体DNA的制备;体外重组连接;将重组DNA导入寄主细胞并扩增;筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(genepoo1)是指在进行有性生殖的某一群体中,能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中,由于使用的载体不同,分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。61如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护?有什么意义?答:在构建基因文库时,可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA先进行甲基化修饰,将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。意义:用这种方法,不但保护了插入片段的大小不会改变,又有利于插入片段的回收,因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来,重组后能够用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。59什么是cDNA文库?同基因组文库有何差别?答:同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板,在无细胞系统中,在反转录酶的作用下,首先合成一互补的DNA,即第一链,破坏RNA模板后,再以第一链为模板合成第二链,得到的双链DNA称为cDNA。选用适合的载体,将合成的cDNA重组导入寄主细胞,经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因,因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表示的时间上并非是统一的,具有发育的阶段性和时间性,有些则需要特殊的环境条件。因此,cDNA文库是不可能构建得十分完全的,也就是说,任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。cDNA文库与基因组文库的主要差别是:(1)基因组文库克隆的是任何基因,包括未知功能的DNA序列;cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因,包括调节基因。(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息,不受时空影响;cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列,因它受发育和调控因子的影响。(3)基因组文库中的编码基因是真实基因,含有内含子和外显子;而cDNA克隆的是不含内含子的基因。62何为稀有酶?(举例说明)答:所谓稀有酶是指那些识别序列在基因组DNA中不常见的酶,因此它们的切割频率较低。如NotI就是最常见的稀有酶,它的识别序列为GC↓GGCCGC。另外有些酶的识别序列虽然不长,但它的识别序列很特别,在基因组出现的频率较低。如NruI(TCGCGA)和BssHII(GCGCGC),它们的靶序列在哺乳动物基因组中出现的频率极低。60什么是同聚物加尾连接法(HomopolymerTailsJoining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点?答:所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工黏性末端,外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能,将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子,该酶能够在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸,如果用Co2+作辅助因子,则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法,具有很多优点:①首先不易自身环化,这是因为同一种DNA两端添加的序列是相同的,因此不存在自身环化;②因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端,因此连接效率较高;③用任何一种方法制备的DNA都能够用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处:①方法繁琐;②外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的序列,可能会影响外源基因的表示。另外要注意的是,同聚物加尾法同平末端连接法一样,重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。,68插入失活法和插入表示法筛选重组体的主要差别是什么?答:主要差别是:(1)插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体。(2)插入表示法是根据一个基因的失活引起另一个基因的表示表型来选择。66构建表示载体应注意些什么?答:(1)构建表示载体的关键是用于表示克隆序列的启动子类型,如果目的是基因的高效表示,就要选用强的启动子;如果表示产物对寄主细胞有毒性,可选择弱的启动子,最好使用可诱导型启动子,使在一定的条件下表示。(2)表示载体还应具有以下组成元件:①携带能在寄主细胞中维持的复制的起始点。②具有抗生素选择标记或其它选择机制。③在紧接启动子的下游安排限制性位点,用于插入需表示的基因。④具有单一的酶切位点来克隆基因,克隆位点应位于准确的位置,以使克隆基因有效表示。67你在做Southern印迹分析,而且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案,下面一个步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶,使DNA变性为单链。为了节省时间,你略过了这一步,直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交,最后发现放射自显影片是空白。错在哪里?提示:转移到膜上的DNA未变性成单链DNA,不能与单链的探针杂交。如果你的杂交探针是双链的,可能因为在加入杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。69一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoRI消化。消化物与酵母DNA连接后转化对两种抗生素都敏感的E.coli菌株。(1)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞?(2)怎样区分接受了插入酵母DNA的质粒的克隆?提示:(1)选择Ampr的转化子;所需的克隆是Ampr和Kans。任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。70用EcoRI和HindIII分别切割同一来源的染色体DNA,并进行克隆。在前者的克隆中筛选到A基因,但在后者的克隆中未筛选到A基因,请说明原因。提示:因为HindHI的切点位于A基因内。71什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?提示:Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上,然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern印迹的不同在于探针的性质不同,在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质),而Southern印迹中使用的探针是DNA。72用一限制性内切核酸酶切割Lac+Tetr的质粒载体,已知该酶识别的是4个碱基序列,并产生有两个碱基突出的单链末端,该酶在lac基因内有切割位点,并在第二个氨基酸密码子内,该位点能够被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后,用DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端,然后重新连接成环,转化Lac-Tet-受体菌,筛选Tetr转化子,问:Lac的基因型是什么?并说明原因。提示:基因型是lac—,原因是在该密码子中插入了两个碱基,造成了移码突变,因此Lac的基因是缺陷的。严谨杂交实验是如何控制的?答:杂交反应的严谨程度由下面两个因素所决定:温度和盐浓度。强的碱基对能耐受高的温度,而高的盐浓度使弱的碱基对间的配对变得稳定。因此,高度严谨的杂交在高温和低盐浓度下进行,而低严谨型杂交在低温和高盐浓度下进行。73RNA与基因组DNA复性已被广泛用于检测不同类DNA的转录。DNA驱动的复性实验与RNA驱动的复性实验有何不同?答:在过量DNA杂交(DNA驱动杂交)实验中,基因组DNA的复性过程中加入少量的放射性标记RNA。因为DNA的量大大超过RNA,因此全部RNA能够与DNA杂交。同样道理,RNA驱动的杂交反应中RNA过量而DNA的量受到限制,因此所有的互补DNA链都能与RNA杂交。74在基因工程中,为了在细菌细胞中表示真核生物的基因产物,为什么一般要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?答:这是因为细菌没有内含子剪接系统,而且不能识别真核生物的启动子的原因。75如何根据下面的应用设计探针?(1)假定你分离纯化了一未知功能的蛋白质,需要确定是何种组织和细胞表示这种蛋白质。(2)假定你获得了绵羊的胰岛素mRNA,如何进一步从人的cDNA文库中获得含人胰岛素的克隆并使之在E.coli中表示?提示:(1)首先对该蛋白质进行部分测序,然后根据测得的氨基酸序列设计简并引物。(2)以该mRNA为模板反转录,得到cDNA,即可进行标记用作探针。76什么是遗传学选择法?答:所谓遗传学选择法(geneticselection)主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬菌斑的变化等。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化,用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表示抗生素平板、显色平板等,由于这些方法都是直接从平板上筛选,因此又称为平板筛选法。77单链RNA作为探针,具有哪些单链DNA探针所没有的优点?答:单链RNA探针的下列优点是单链DNA探针所没有的:(1)RNA／RNA和RNA／DNA比DNA／DNA杂交体具有更高的稳定性。因此,杂交能够在更严格的各件下讲行．杂交后的信号也比较强。(2)单链RNA由于不存在互补双链的竞争性结合,因此杂交效率比较高。3)RNA中不存在重复序列,因此特异性比较高。(4)杂交后可用RNase消化掉未杂交的RNA,因此降低了本底。78良好的固相支持物(如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜)必须具备哪些优良特性?答:(1)同核酸分子具有较强的结合能力,一般要求每平方厘米结合核酸分子的量在10μg以上。(2)与核酸分子结合后,不影响其同探针分子杂交的反应。(3)与核酸分子的结合牢固,能经受得住杂交、洗涤等过程而极少脱落。(4)非特异性吸附少,在洗膜条件下,能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱。(5)具有良好的机械性能,不宜破碎。简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。(1)COS位点能够自身环化(2)能够利用COS位点包装l噬菌体颗粒;(3)能够感染寄主细胞;(4)利用质粒复制子复制,不整合、不裂解。79以硝酸纤维素滤膜(NitrocelluloseFilterMembrane)作为杂交的固相支持物具有哪些优、缺点?答:优点:(1)硝酸纤维素滤膜具有较强的吸附单链DNA和RNA的能力,特别在高盐溶液中,结合能力达到80～100μg／cm2。(2)杂交信号本底较低。由于硝酸纤维素滤膜非特异性吸附蛋白质的能力较弱,因此特别适合于那些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射性标记探针的杂交体系。缺点:(1)它同DNA的结合仅是靠疏水性的相互作用,因此并不十分牢固,在洗膜时,特别是在高温条件下洗膜,DNA会慢慢脱落,因而影响杂交效率。(2)硝酸纤维素滤膜容易碎裂,操作不方便。(3)硝酸纤维素滤膜在低盐浓度下同DNA结合的能力不强,因此不适宜电转移印迹法。(4)硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。80什么是印迹(Blotting)杂交?答:经过一定的物理学方法将DNA或RNA从凝胶上转移到固体支持物(如NC膜),然后同液体中的探针进行杂交。DNA或RNA从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹,故将这种杂交称为印迹杂交(BlottingHybridization)。如Western印迹、Southern印迹、Northern印迹。81什么是斑点杂交(DotHybridization)与狭缝杂交(SlotHybridization)?答:将DNA或RNA样品直接点在固体支持物上,然后与核酸探针进行分子杂交,这种方法称为斑点杂交。如果借用一种模具,将核酸样品加到模具的狭缝中,经过真空抽滤印迹到滤膜上,然后进行杂交称为狭缝印迹杂交。82什么是原位菌落杂交(ColonyHybridization)?答:将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌,原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上,然后用放射性标记的探针同固定了的DNA进行杂交,经放射自显影后,确定哪一个菌落含有重组的DNA分子,再从参比平板上选取重组体。83说明Southern杂交的原理和方法。Northern印迹与Southern印迹有什么不同?答:Northern印迹的原理同Southern印迹相比有两点不同:(1)转移的对象不同,Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后,将其转移到固相支持物上的过程。(2)虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切,但也需要变性。不过变性方法是不同的,它不能用碱变性,只是在加样前用甲醛、乙二醛或甲基氢氧化银变性,因为碱变性会导致RNA的降解。为什么反转录酶在聚合反应中会出错?外切核酸酶是从噬菌体感染的E．coli中分离纯化的,能够从双链DNA上依次切下5'单核苷酸,作用底物是双链DNA的5'磷酸末端,不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链DNA,但效率较低(下降200倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的,一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5'末端,以便让末端转移酶加尾。什么是测序酶(sequenaseTM)?所谓测序酶即是修饰了的T7DNA聚合酶,是采用缺失的方法,从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸,这样使T7DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性,只有5'---3'聚合酶的活性,而且聚合能力提高了3～9倍,测序时常见此酶。酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在,必须有哪些基本的结构?(1)着丝粒;(2)端粒;(3)ARS序列。19Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?PCR用双引物,体内复制用单引物。欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表示,克隆时应注意哪些问题?应注意的问题有:启动子、密码子、剪接、分泌。21．假定你分离到一个E．coli的Thy-突变体,并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因,测定突变的序列。(注:E．coli野生型的ThyA基因的序列是已知的为了扩增突变体的thyA基因,先设计一对引物,其中一个引物的序列与thyA基因的5’端相同,另一个引物同该基因的3’端互补。在引物的5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后,进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳,纯化扩增片段,能够直接测序或克隆到合适的载体再测序。25什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上,然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同,在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。λ外切核酸酶(1ambdaexonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?外切核酸酶是从噬菌体感染的E．coli中分离纯化的,能够从双链DNA上依次切下5'单核苷酸,作用底物是双链DNA的5'磷酸末端,不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链DNA,但效率较低(下降200倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的,一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5'末端,以便让末端转移酶加尾。Mn2+、Mg2+对DnaseI(deoxyribonuclease?)的活性有什么影响?DnaseI在基因工程中有什么作用?DNaseI是一种内切核酸酶,在Mg2+存在下,DNaseI随机切割DNA两条链中的任意一条链;当Mn2+代替Mg2+时,DNaseI几乎是在双链DNA两条链相正确位置上打开缺口,使双链DNA断裂,产生的末端几乎是平末端或只突出1～2个核苷酸的DNA片段。DNaseI有许多用途:(1)在切口移位标记中,制造切口;(2)在足迹法中保护DNA;(3)除去RNA制备物中的DNA;(4)体外转录中除去DNA模板;(5)检测染色体中的转录活性区;(6)产生可在噬菌体M13载体上进行测序的随机克隆。蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?b—半乳糖苷酶的N末端是非必须的,,能够进行修饰,并不影响酶的活性或a肽的互补性。如果插入的外源DNA引起a肽的可读框的改变,或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话,就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数,或者插入的DNA中不含有终止密码的话,依然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质能够用来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框,即移码突变。辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区,能够合成单链DNA,可是它没有M13的功能基因,没有M13基因2的产物存在,因此不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因,可是IG区是缺陷的,辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制,于是就能够为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。辅助噬菌体必须具备如下条件:(1)助噬菌体的DNAIG区必须失去功能,其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中;(2)由于辅助噬菌体的IG区失活,其本身的基因不能表示,要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表示,必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点;(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记,便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成,能够经过何种方法克隆该基因?能够经过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表示文库中筛选相应的克隆。黏性末端连接法是最常见的连接方法,具有许多优点,可是也有一些不足,请指出这些不足之处。黏性末端连接法不足之处有:(1)载体易自身环化;(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆;(3)难插入特定的基因;(4)再者就是大片段DNA的重组率较低,即使用碱性磷酸酶处理了载体,防止了载体的自身环化,载体也有成环的倾向;(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体,增加筛选工作的困难。何谓接头连接法(1inkerligation)?将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列),加到载体或外源DNA的分子上,这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子,这种方法称为接头连接法。什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?同裂酶是一类识别序列不完全相同,可是产生的黏性末端至少有四个碱基相同的限制性内切核酸酶。用这些限制性内切核酸酶处理载体和外源DNA得到的末端能够经过黏性末端连接法连接。同裂酶产生的黏性末端虽然能够像完全亲和的黏性末端那样进行连接,可是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是,连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点,可是能够被另外一种同裂酶识别。这样用同裂酶进行体外重组时,在限制性内切核酸酶切割反应之后不必将原有的内切酶失活,就可直接进行重组连接。由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在,就不会发生载体自连,从而保证了载体同外源DNA的连接。因此在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。反应中一般要涉及三种不同的限制性内切核酸酶,其中两种是识别六碱基的酶,另一种是识别四碱基的酶。为了大量获得许多用于生化鉴定的产物,你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表示,你如何确保最终能得到产物?由于基因已被测序并进行了分析,因此前体mRNA结构是已知的。这对了解蛋白质的功能区是十分重要的,能够避免有关多肽翻译后加工的一些问题。对于间断基因,cDNA能够用外显子DNA探针经过体外杂交得以鉴定。将拟南芥的基因组DNA或cDNA分别克隆到酵母人工染色体(YAC)上作为定位或筛选的融合标签,基因能够在酵母中作为细胞质蛋白质或分泌蛋白质进行表示。放射性抗体检测法(radioactiveantibodytest)的基本原理是什么?这一方法的基本原理是根据抗体、抗原分子的三个基本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法。这三个基本特性是:(1)抗体分子能够牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯塑料)上而不被洗脱掉;(2)一个抗原能够同几种不同的抗体结合;(3)抗体分子能够经过碘化作用被125I标记。什么是随机引物(randomprimer)?如何标记DNA?随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体,含有各种可能的排列顺序(46=4096);或是用DNA酶处理小牛胸腺DNA后获得的6—12个碱基的片段。将待标记的DNA片段同随机引物一起进行杂交,并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物,在Klenow酶的作用下合成互补DNA链,当反应底物中有放射性的dNTP时,新合成的DNA就带上了标记。基因文库构建的一般步骤:(1)染色体DNA大片段的制备①酶切法②物理切割法(2)载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接②人工接头法(3)转导受体(4)筛选重组子说明Southern杂交的原理和方法。1975年Southern建立起来的一种杂交方法,属固相—液相杂交。该法的主要特点是利用毛细现象将DNA转移到固体支持物上,称为Southern转移或Southern印迹(Southernblotting)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将DNA切割,进行电泳分离后,利用干燥的吸水纸产生毛细作用,使液体经过凝胶,从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面。33．建立了一个基因文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆?带有某一细菌基因的克隆一般能够直接看出来,因为基因表示引起了宿主细胞表型的可见变化。然而,真核生物的基因不都表示,则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常见方法是杂交(图A21．