鸡马立克氏病病毒PCR检测法

鸡马立克氏病病毒PCR检测法1、概述针对MDV血清1型病毒特有的meq基因和132碱基重复序列（132bpr）的PCR检测，可以对MDV血清1型病毒感染进行检测和鉴定；同时可以对野毒株和疫苗株感染加以区分。2、试剂2.1阴性和阳性对照：分别为SPF鸡的组织和MDV强弱毒细胞株培养物提取的核酸，-2（rc保存。2.2组织细胞裂解液：为病毒总DNA提取试剂。2.3苯酚，氯仿，异戊醇；均为分析纯。2.475%乙醇：用无水乙醇和水配制，-2（TC预冷。3、器材PCR扩增仪。台式低温高速离心机。稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。凝胶成像仪（或紫外透射仪）。-2（rc冰箱。微量可调移液器（0.5uL〜10uL、5uL〜40uL、40uL〜200口L和200uL-1000口L各1支）。PCR扩增管。4、操作方法样品准备本方法适用所有的MD病原样品包括羽髓、肝脏、脾脏、肾脏等器官。以及淋巴细胞与细胞培养物等。在无菌环境中，将采集的动物机体组织研磨，加PBS洗2次，12000r7min离心lOmin,取沉淀用于提取总DNA。细胞样品不需要研磨处理，直接用于提取总DNAo核酸提取.1酚氯仿法C.2.1取待检样本、阴性对照阳性对照各5HL〜10uL(lug/uL)分别置于15mL离心管中，每管加入1OOOuL组织细胞裂解液，置于371水浴4h期间适当旋转混匀。C.2.2将溶液冷却至温，加入等体积的用lOOmmol/LTris-ClpH8.0平衡过的苯酚颠倒混匀；下，12000r离心10minoC.2.3用宽口移液管吸出水相于新的干净的离心管中，重复步骤C.2.2OC.2.4用宽口移液管吸出水相于新的干净的离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)倒转混匀成乳浊状，静置5min后，12000r离心10minoC.2.5用宽口移液管吸出水相于新的干净的离心管中，加入等体积的异戊醇，倒转混匀，静置5min后，12000r离心lOmin。C.2.6重复步骤C.2.5oC.2.7用宽口移液管吸出水相于干净的离心管中，加入25倍体积的无水乙醇，倒转混，-201静置2h,4℃12000r/min离心20min后，弃尽上清。C.2.8沉淀用75%的冷乙醇洗涤2次，12000r/min离心lOmin,尽量吸干液体；室温干燥5min〜lOmin。C.2.9每管加入10uLTE缓冲液（pH8.0）溶解DNA。提取的DNA即可用于PCR扩增，也可以-70七冰箱储存备用。4.2.2核酸提取等效方法MDV核酸提取可以采用细胞、血液和组织提取试剂盒，按照使用说明书操作。4.3PCR扩增4.3.1扩增试剂的准备在试剂配制区进行。设PCR反应数为n,n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，宜按n+1个反应进行配制。将上下游引物，Taq酶，buffer,dNTP和去离子水按照使用量加入到一个离心管中，混匀，每个PCR管中分装19UL记录好待检样品管、阴性对照管、阳性对照管，转移至样本处理区。4.3.2加样在样本处理区进行，在已分装有PCR反应液的PCR扩增管中分别加入已制备好的DNA溶液1uL,盖紧。4.3.3PCR反应将PCR管放入PCR扩增仪中，按照设定扩增条件进行扩增。4.4琼脂糖凝胶电泳4.4.1制备1%琼脂糖凝胶板。依据样品数选用适宜的梳子，待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中加1XTAE缓冲液淹没胶面。4.2加样取6uL〜8uLPCR扩增产物和加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时加样标准DNAMarker、阴性对照、阳性对照。4.3电泳：电压0V〜100V或电流40mA〜50mA；电泳30min〜40min。5、PCR检测结果判定1试验成立判定电泳结束后.取出凝胶板置于紫外透射仪或凝胶成像系统观察。阳性对照样品，meq基因应检测到786bp大小条带，132bpr应检测到317bp大小的条带，且阴性对照无扩增条带，则试验成立；否则，此次试验视为无效。5.2阳性判定2.1若待检样品扩增结果meq基因检测为786bp或963bp大小条带；132bpr检测产物为317bp或449bp大小单一条带，或者为多带型条带（存在2条以上的条带，一般可出现5条〜8条，大小为185bp,317bp,449bp,58Ibp,713bp,845bp,977bp,1109bp）,表明检测样品中MDV血清1型病毒阳性（示例图见C）o（图C1132bpr引物扩增结果示例图）（图C2meq引物扩增结果示例图）2.2若待检样品扩增结果,meq基因检测为786bp大小条带，132bpr检测为317bp或449bp大小单一条带，表明该MDV为野毒株（示例图见C）。2.3若待检样品扩增结果meq基因检测为963bp大小条带，132bpr检测为多带型条带（存在2条以上的条带，一般可出现5条〜8条，大小为185bp,317bp,449bp,581bp,713bp,845bp,977bp,1109bp）表明检测样品中MDV血清1型病毒阳