细胞培养无菌操作基本技术

细胞培养无菌操作基本技术(1)实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70%酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台.如需要继续进行下一个实验,则用70%酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作.

(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内.实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作.

(3)小心取出无菌实验用品,避免造成污染.切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验.容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上.

(4)工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验.对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级).操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐物品伤人等.

(5)定期检查下列项目:CO2钢瓶内的CO2压力;CO2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污染;无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预滤网,3000小时/HEPA).细胞培养基种类与基本成分氨基酸

氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺.碳水化合物

碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脱氧核糖,丙酮酸钠和醋酸等.无机盐

培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能.培养液的渗透压是一个非常重要的因素,细胞通常可耐受260mOsm/kg320mOsm/kg.标准培养液的渗透压在此范围内波动.特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质.向培养液中添加HEPES时需按以下方法调节钠离子浓度.缓冲系统

大多数细胞所需pH在7.2-7.4.但是,细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH(7.4-7.7),而传代转化细胞系则需要偏酸pH(7.0-7.4).由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲,因此,气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%,培养液中NaHCO3的加入量为1.97g/L;如果CO2浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L.细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换.HEPES是一种非离子缓冲液,在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力,但是非

常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加.在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中.大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色.维生素

在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源,但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长.其它成分

在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分.如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me对细胞生长有很重要的作用.有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用.同时避免过氧化物对培养细胞的损害.另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞.2-Me是一种小分子还原剂,极易氧化.分子量为78.13,纯的2-Me是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(Do20),常用终浓度为5×10-5M.常配制成0.1M的储存液,用时每升培养液加0.5ml.细胞计数与存活测试1.原理：

1.1.计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

1.2.血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

1.3.存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。

2.材料：

2.1.0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

2.2.Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa/Mgfreesaline

2.3.血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)

2.4.计数器(counter)

2.5.低倍倒立显微镜

2.6.粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步骤：

3.1.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

3.2.取少许混合液(约15ml)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。

3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

4大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml

*每一大格的体积=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

3.4.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。

3.5.范例：

T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55,62,49,59

死细胞数/方格：5,3,4,6

细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75

稀释倍数=2

细胞数/ml：60.75x104x2=1.22x106

细胞数/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%细胞培养培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。

2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

3.粉末培养基配制(以1升为例)：

3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

3.2.材料：

3.2.1.纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)

3.2.2.粉末培养基

3.2.3.NaHCO3(SigmaS-4019)

3.2.4.电磁搅拌器

3.2.5.无菌血清瓶

3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜

3.2.7.pHmeter

3.2.8.真空帮浦

3.2.9.CO2气体

3.3.步骤：

3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。

若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4.配制培养基之生长测试

4.1.材料：

4.1.1.MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

4.1.2.6-wellTCplate(or35mmTCdish)

4.1.3.methanol

4.1.4.glacialaceticacid

4.1.5.10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

4.2.步骤：

4.2.1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组实验。

4.2.2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

4.2.3.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10min。

4.2.4.去除固定液，水洗二次。

4.2.5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

4.2.6.去除染液，水洗二次。

4.2.7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。无菌操作注意事项体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。

【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。

【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)．紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。基因疫苗GeneVaccine基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。超净台工作原理及使用方法超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，预备时间短，开机10分钟以上即可操作，基本上可随时使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台由三相电机作鼓风动力，功率145～260W左右，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气”，它除去了大于0.3μm的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为24～30m/min，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工作人员就在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移接种过程中不受污染。但是万一操作中途遇到停电，暴露在未过滤空气中的材料便难以幸免污染。这时应迅速结束工作，并在瓶上作出记号，内中的材料如处于增殖阶段，则以后不再用作增殖而转入生根培养。如为一般性生产材料，因极其丰富也可弃去。如处于生根过程，则可留待以后种植用。

超净台电源多采用三相四线制，其中有一零线，连通机器外壳，应接牢在地线上，另外三线都是相线，工作电压是380V。三线接入电路中有一定的顺序，如线头接错了，风机会反转，这时声音正常或稍不正常，超净台正面无风(可用酒精灯火焰观察动静，不宜久试)，应及时切断电源，只要将其中任何两相的线头交换一下位置再接上，就可解决。三相线如只接入两相，或三相中有一相接触不良，则机器声音很不正常，应立即切断电源仔细检修，否则会烧毁电机。这些常识应在开始使用超净台时就向工作人员讲解清楚，免除不应造成的事故与损失。超净台进风口在背面或正面的下方，金属网罩内有一普通泡沫塑料片或无纺布，用以阻拦大颗粒尘埃，应常检查、拆洗，如发现泡沫塑料老化，要及时更换。除进风口以外，如有漏气孔隙，应当堵严，如贴胶布，塞棉花，贴胶水纸等。工作台正面的金属网罩内是超级滤清器，超级