CD19-CAR-T细胞制备工艺

未经允许不得复印未经允许不得复印未经允许不得复印未经允许不得复印■・“■・GenTarGet作业指导书深圳精准医疗科技有限公司受控印章文件名称文件编码页数第1页共6页起草人起草日期年月日颁发部门质量管理部审核人审核日期年月日颁发日期年月日会签人批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门研发部、市场部、质量管理部CD19-CAR-T细胞制备工艺规程目的：制备符合规定、合格的CD19-CAR-T细胞范围：职责：3.1技术人：负责按本工艺规程进行细胞制备3.2实验室主管：负责本工艺规程的执行。3.3质量部：负责细胞制备全过程的监督和管理。内容：4.1产品名称、剂型、规格：•产品名称：CD19-CAR-T•产品剂型：•规格：100mL•性状：液体•存储条件及效期：•内包装：4.2产品的质量标准：详见《XXX细胞质量标准》4.3仪器、设备一览表:序号仪器设备性能要求序号仪器设备性能要求1洁净工作台/生物安全柜A级8条码打印机

2二氧化碳培养箱9医用40C冰箱3普通离心机10超低温冰箱4掌上离心机11热合机5倒置显微镜12水浴锅6可调式移液器（移液枪）13细胞计数仪7电动辅助移液器14*■*■・・・・・•GenTarGet作业指导书深圳精准医疗科技有限公司文件编码：第2页共6页受控印章GenTarGet受控印章作业指导书4.4试剂一览表:序号试剂名称规格1细胞培养基1L/瓶2细胞因子Alug/uL3细胞因子B106IU/mL4淋巴细胞分离液500mL/瓶6转染增效剂8ug/mL7生理盐水500mL/瓶8CD19-CAR-T慢病毒上清10mL/支4.5耗材一览表:序号耗材规格1细胞培养板24孔板6孔板2细胞培养瓶T25T75

T1753培养袋2L/个4离心管15mL50mL250mL5移液管5mL10mL25mL6细胞滤网100目/个7输液袋100mL8巴氏吸管3mL/5mL9EP管1.5mL*■*■・・・・・•GenTarGet作业指导书深圳精准医疗科技有限公司文件编码：第3页共6页受控印章GenTarGet受控印章作业指导书4.6试剂的配制：4.6.1培养基：将1支106IU的细胞因子B溶于1L培养基，配成完全培养基1。取4OmL完全培养基1,加入2uL细胞因子A,配成完全培养基2。4.7细胞制备工序要求：工序操作间洁净级别设备名称洁净级别细胞制备制备室C级洁净工作台/生物安全柜A级细胞培养培养室C级CO2培养箱C级细胞收集制备室C级洁净工作台/生物安全柜A级4.8细胞制备流程图

*■・・■・・・・・・・GenTarGet作业指导书深圳精准医疗科技有限公司文件编码：第4页共6页受控印章Day0Day0Day1Day0Day0Day1Day2™8细胞因子激活T细胞|细电因子A、B带CD3■亠CAR的慢病毒上清转染T细胞|專職剖-细血因子E

培养数天，扩增基因修饰的T细.亦Day10^12Day10^12IDay10^12Day10^124.9细胞制备:4.9.1第0天:第0天外周血交接1、技术贝检查：A存放血液的容器是否兀好并密封；标识是否清晰完整并正确；血液是否结块，是否有溶血；血液量是否与标识一致。2、检查确认合格后，填写《标本采集交接记录》，双人签名确认。3、接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制备区。制备前准备1、淋巴细胞分离液和培养基恢复至室温。2、准备好若干50mL离心管和24孔培养板。单个核细胞的分离提取取出500uL全血置于干净的1.5mLEP管中，用于血液二分类和流式检测。将外周血用生理盐水按1:1体积比稀释。

加入15mL淋巴细胞分离液至50mL离心管管底，用25mL移液管将35mL血细胞小心缓慢铺在淋巴细胞分离液上（电动移液器吹液速度为零）。1800rpm,20min常温离心，离心机升6降3。小心移去生理盐水层，吸取白膜层至50mL离心管，补加生理盐水至离心管满体积，500g,5min常温离心。倒去上清，加入生理盐水，重悬细胞，常温离心。洗2-3遍。用完全培养基2重悬细胞，计数。T细胞重悬和诱导活化1、按3X106个细胞/mL/well铺在24孔板上。2、将24孔置于二氧化碳培养箱中（37°C,5%二氧化碳）培养。清场1、将被血液污染的耗材弃置在生物安全垃圾袋中。2、完全培养基1和2配制完后4度保存。注意事项1、*■*■・・・・・•GenTarGet作业指导书深圳精准医疗科技有限公司文件编码：第5页共6页受控印章GenTarGet受控印章作业指导书4.9.2第1天（细胞培养24小时）:第1天带CD19-CAR慢病毒上清转染T细胞1、将24孔板的细胞收集，用生理盐水洗涤两次，500g,5min常温离心。2、用带CD19-CAR慢病毒上清重悬细胞，计数，并用病毒上清稀释至终浓度3X106个细胞/mL，加入总体积千分之一体积的转染增效剂。3、1000g，离心，2h。4、在二氧化碳培养箱培养8小时后每个24孔板的孔补加500uL完全培养基1。注意事项1、4.9.3第3天（转瓶、补液）第3天转瓶、补液1、将24孔板的细胞转入T75的细胞培养瓶，并补充等倍体积的完全培养基1进T75的细胞培养瓶。注意事项1、

*■・・・・・・GenTarGet作业指导书深圳精准医疗科技有限公司文件编码：第6页共6页受控印章4.9.4第5天（转袋、补液）:第5天CD19-CAR-T细胞转袋补液11、补充完全培养基1至400mL后，转入2L的培养袋中继续培养。注意事项1、转袋后间隔1天摊开手掌轻压一下培养袋，以推散细胞聚集。注意事项操作完，及时清场，并做好相关记录以及细胞制备档案填写。清场1、4.9.5第10天（收获细胞）第10天收获细胞1、将2L培养袋的细胞培养液分装至225mL的离心管中，500g,5min。2、将细胞用生理盐水洗两次，并用100mL生理盐水重悬。3、将细胞悬液过细胞滤网后，进袋，密