血站专业研究-免疫性血小板输注无效的原因与对策

免疫性血小板输注无效

的原因及对策血小板表面抗原-共有抗原HLA抗原：血小板具有HLA-Ⅰ类抗原（HLA-A、HLA-B抗原和少量HLA-C抗原），无HLA-Ⅱ类抗原。故输注血小板要比器官移植所需配型简单。HLA-Ⅰ类分子为血小板的固有蛋白，少量从血浆中吸附。ABH抗原：部分为血小板的固有蛋白，另一部分从血浆中吸附。血小板上的ABH抗原个体之间表达不同，5%-10%的非O型个体为A抗原或B抗原的高表达者

，故血小板输血应同型输注。其他抗原：Ii,Lewis

(Lea,Leb),

P2血小板特异性抗原（humanplateletantigen,HPA)主要存在于血小板膜的糖蛋白（GP）分子上，构成血小板膜结构的一部分，也少量存在于血管内皮细胞、结缔组织细胞和平滑肌细胞上；1990年国际输血协会（ISBT）血小板免疫学工作组对HPA进行了命名，以发现的时间顺序排列：HPA-1、-2、-3、-4、-5和-15等系统，每一系统由两个对偶抗原组成，其中高频率基因表达的抗原以a表示，低频率基因表达的抗原以b表示，如果尚未发现对偶抗原，则给予暂时命名，在等位基因数字后面加w表示。

#MetcalfeP,etal.VoxSanguininis,2003,83(3):240血小板表面抗原-特异性抗原系统抗原原名发现时间糖蛋白CD核苷酸多态性疾病相关性HPA-1HPA-1aZwa，plAl1959GplllaCD61167TPTPHPA-1bZwb，plA21961167CPTPHPA-2HPA-2aK0b1961GplbαCD42b482CNAITHPA-2bK0a，Siba1965482TNAITHPA-3HPA-3aBaka，Leka1980GpllbCD412621TNAITHPA-3bBakb19882621GPTPHPA-4HPA-4aYukb，Pena1985GplllaCD61506GNAITHPA-4bYuka，penb1986506ANAITHPA-5HPA-5aBrb，Zavb1998GplaCD49b1600GNAITHPA-5bBra，Zava，Hca19891600ANAITHPA-15HPA-15aGovb1993CD109CD1092108CPTRHPA-15bGova19902108APTRHPA-6bwCaa，Tua1995GplllaCD611544G>ANAITHPA-7bwMoa1997GplllaCD611297C>GNAITHPA-8bwSra1994GplllaCD611984C>TNAITHPA-9bwMaxa1995GpllbCD412602G>ANAITHPA-10bwLaa1999GplllaCD61263G>ANAITHPA-11bwGroa2002GplllaCD611976G>ANAITHPA-12bw1ya1990GplbβCD42c119G>ANAITHPA-13bwSita1995GplaCD49b2483C>TNAITHPA-14bwOea2002GplllaCD611909-1911delAAGNAITHPA-16bwDuva1992GplllaCD61497C>TNAITHPA-17bwVaa1998GplllaCD61622C>TNAIT血小板特异性抗原PTP，输血后紫癜；NAIT，新生儿同种免疫血小板减少症；PTR，血小板输注无效#

赵桐茂，人类血小板抗原（HPA）研究概况，中国输血杂志，2004,17(2):129-132。HPA-1HPA-2HPA-3HPA-4HPA-5HPA-15人群

1a1b2a2b3a3b4a4b5a5b15a15b越南人0.9860.0140.9530.0470.4860.514100.972*0.028*0.5230.477澳大利亚土著人0.9970.0031*0*0.932*0.068*100.754*0.246*中国台湾0.9970.0030.9600.040.575*0.425*0.9980.0020.9850.015亚马逊印第安人100.9630.0370.708*0.292*100.9630.0370.78*0.22*非裔美国人0.92*0.08*0.82*0.18*0.63*0.37*100.79*0.21*韩国人0.9950.0050.87*0.13*0.67*0.33*100.97*0.03*高加索人0.85*0.15*0.930.070.610.390.9990.0010.89*0.11*日本人0.9910.0090.9000.1000.718*0.282*0.9900.0100.9730.027中国人（山东）0.99570.00430.94660.05340.53630.4637100.99150.00850.51500.4850*与中国人（山东）相比p<0.05#

朱传福，山东汉族人群血小板特异性抗原基因多态性研究及其资料库的建立，2006，硕士论文不同种族、地区人群HPA-1~5和-15基因频率比较血小板抗原定型（PCR-SSP）HPA-1HPA-2HPA-3HPA-4HPA-5HPA-15abababababab阳性对照条带等位基因条带1bb2ab3bb4aa5aa15aa用途：（1）健康人群HPA基因分型，建立已知HPA基因型的血小板献血员库。（2）检测受者HPA基因型，以便从血小板献血员库中寻找与其HPA基因型相匹配的血小板供者。（3）检测患者HPA基因型，辅助临床胎儿/新生儿免疫性血小板减少症、输血后紫癜及血小板输注无效症等疾病的病因诊断。（4）对特定区域或种族人群HPA基因分型，可为人类遗传学研究提供相关资料和证据。血小板输血必要性

轻度血小板减少症患者血小板计数<50×109/L，会出现凝血障碍，导致出血不止，特别对于严重失血患者、产妇等。严重血小板减少症患者血小板计数<10×109/L，会出现自发出血、颅内出血甚至死亡，特别对于白血病、肿瘤化疗、骨髓异常综合症及特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者等。一项有关血小板计数和出血发生率的关系的研究显示，当血小板计数在5-14

×109/L之间时，出血发生率比10-29×109/L的患者高出2倍，而当血小板计数处于0-4×109/L之间时，出血发生率则要增加8倍。-Heddle,N.M.,Cook,R.J.etal.2006，Transfusion,46,903–911)血小板输注无效（PTR）的定义简单定义：血小板输注后血小板计数值低于预期；标准定义：输注ABO相合新鲜血小板后连续两次10分钟到1小时校正后血小板计数增加值（CCI）低于5×109/L（美国临床肿瘤协会）；临床指标：血小板输注后出血趋势不减轻，或出现输血性紫癜，出血加重。血小板计数较输注前又有下降。血小板输注无效的判断标准临床指标：血小板输注后出血趋势不减轻，或出现输血性紫癜，出血加重。血小板计数较输注前又有下降。血小板计数增加指数(CCI)

（输注后血小板计数-输注前血小板计数）×体表面积（m2）输入的血小板数（×1011

）

1小时CCI〈7.5×109/L或者24小时CCI〈4.5×109/L

连续两次则定义为血小板输注无效；

血小板回收率（PPR）CCI=血液总量预测值*×血小板计数增加值输入的血小板数

*可以按照75mL/kg估算成人血液总量

24小时PPR%〈20%,定义为血小板输注无效。PPR(%)=判断PTR时遇到的问题输入的血小板数？1U的机采血小板=4×1011（FDA>3×1011），成人体表面积=2.0能否用10分钟CCI代替1小时CCI？1小时CCI和20小时CCI的相关性非常高（r=0.67），20小时CCI大约等于1小时CCI的64%；1小时CCI值低=免疫性PTR？24小时CCI低=临床因素?血小板输注后1小时,CCI＜7.5×109/L因首先考虑免疫因素所致,若血小板输注后1h的CCI指数在正常范围内,而24h的CCI<4.5×109L,则应考虑非免疫因素所致。

非免疫性因素血小板本身质量；患者情况：发热、感染、脾肿大、弥散性血管内凝血（DIC）及药物作用；约占到血小板输注无效的80%

-Novotny,V.M.1999,VoxSanguinis,76,1–13免疫性因素同种异体免疫作用：HLA-Ⅰ类抗体、HPA抗体、ABO血型抗体；自身免疫作用：ITP患者；药物免疫作用：肝素、奎宁、头孢菌素、苯巴比妥、消炎痛、安替比林等；约占血小板输注无效的18-30%，18%--LeglerTJ,FischerI,DittmannJ,etal.1997;74:185-9.25%--DoughtyHA,MurphyMF,MetcalfeP,etal.VoxSang1994;66:200-5.28%--Heddle,N.M.,Cook,R.J.etal.2006，Transfusion,46,903–911.).29.02%--JiaY,etal.2014,TransfusMed;24(6):406-410.血小板输注无效的原因血小板无效输注的应对策略1、以非免疫因素为主的输注无效应以治疗原发病为主，增加输注血小板数量和质量来提高血小板输注的效果；2、以免疫因素为主的病例则以预防为主，预防相关抗体的产生，也就是说输注配型相合的血小板，即ABO血型相合、HLA配型相合、HPA配型相合；PlateletAntibodyAssays(HPAandHLA)技术方法HPAHLA-I特点CDC(LCT)否

是只能检测到补体结合的抗体SPRCA-F是是操作方便，结果判读容易，重复性好，但是需要完整血小板和指示红细胞，不能区分抗体特异性MAIPA是

是灵敏度高，特异性好，可区分HPA的特异性LABScreen-SAB否是分辨率最高，可确定HLA-I抗体的特异性HLA及HPA抗体检测技术SPRCA-F（固相红细胞吸附实验）

（SolidPhaseRedCellAdherenceAssaywithfrozenplatelets）“U”型底微孔板包被抗人血小板抗体以捕获血小板将血小板加入到微孔板内离心使血小板平铺于空底部形成单层加入患者血清，孵育，使其中的抗体结合到血小板上加入抗人球蛋白二抗加入包被有抗D抗体的RhD指示红细胞抗人球蛋白连接血小板抗体和抗D抗体阳性反应呈现平铺的红细胞单层MAIPA（血小板单克隆抗体特异性固定技术）

MonoclonalAntibody-SpecificImmobilisationofPlateletAntigens

(抗原捕获Elisa)血小板HLA/HPAab洗涤洗涤鼠抗GPab裂解免疫复合物EE底物呈色洗涤洗涤羊抗鼠ab羊抗人abHLA/HPAab荧光微球HLA抗原纯化的抗原包被到荧光微球上YYYY荧光微球YYYYYYYYYYYY患者血清中的HLA抗体与微球上的HLA抗原结合PE标记的抗人IgG二抗与抗体结合YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY荧光微球LuminexLABscreen®(流式PRA检测技术)血小板抗体检测方法比较CDC酶标法荧光法固相凝集法应用范围抗体检测√√√√交叉配型√√√性能灵敏度低高极高高特异性不好好一般较好反应时间长＞2h＞2h＜1h所用仪器显微镜酶标仪荧光显微镜或流式细胞仪平板离心机，洗板机16th版AABB评价未提及特异性鉴定的可靠方法敏感性高特异性不足血小板交叉配型应用最为广泛的方法方法指标六、血小板输注无效患者抗体检测及交叉配血流程抗体检测申请单、送血样ELISA方法检测HLA/HPA抗体抗体检测报告记录抗体阳性患者信息检测报告交付患者阳性患者可申请交叉配血交叉配血申请单送血样签署知情同意书固相凝集法进行交叉配血（每个血型四个供者样品）挑选交叉配血相合的血小板、填写标签、贴到相应的血小板血袋上血小板交叉培训结果报告单送中心血库、血库发血临床输注ELISA方法筛查血小板抗体LIFECODES®Pakplus;HLAI类抗体，

抗血小板糖蛋白GPIIb/IIIa、GPIa/IIa、GPIb/IX和GPIV血小板特异性抗体；GPIIb/IIIaGPIa/IIaGPIb/IXGPIVHLA空白孔阳性对照阴性对照患者样品微孔板上包被的是来自于O型血小板的GPIIb/IIIa、GPIa/IIa以及亲和纯化的GPIb/IX、GPIV和HLA-I类抗原酶标仪检测405或410nm处OD值，样品的OD值大于等于阴性对照的2倍被认为是阳性结果。EEEEEEEEEEEEE加入300μl洗涤缓冲液室温孵育5-10分钟，弃去洗涤液加入50μl血清或阴性和阳性对照样品37℃水浴30-35分钟，300μl洗涤缓冲液洗涤3-4次加入50μl碱性磷酸酶标记的抗人球蛋白37℃水浴30-35分钟，洗涤3-4次加入100μlPNPP溶液，避光室温孵育30分钟加入100μl终止液EGPIIb/IIIa、GPIa/IIa/、GPIb/IX、GPIV或HLA-I类抗原HLA-I或HPA抗体碱性磷酸酶标记的抗人球蛋白（anti-IgG/A/M)底物PNPP（对硝基苯磷酸二钠）对硝基酚钠，黄色水溶性血小板交叉配血试验MASPAT（MonoclonalAntibodySolidPhasePlateletAntibodyTest)kit供血者血小板反应板（已包被血小板单抗）血小板单层阳性反应受血者血清/血浆抗人IgG指示红细胞（人IgG致敏红细胞）50g,5min离心洗涤3次50μl/孔洗涤5次水浴30min阳性阴性50μl/孔各50μl/孔200g,5min离心200g,5min离心阴性反应A123A+++B+/-+/-+C+/-+/-+D+/-++/-E+--F++-G+++H+++A1-D1：患者1（A）E1-H1：患者2（A）A2-D2：患者3（B）E2-H2：患者4（B）A3-D3：患者5（O）E3-F3：阴性对照G3-H3：阳性对照A1-D1：A型供者1-4E1-H1：A型供者1-4A2-D2：B型供者1-4E2-H2：B型供者1-4A3-D3：O型供者1-4E3-H3：三个O型血小板混合物characteristicsTotal(n=193)Platelet-specificantibodypositive(n=56)Age(years),mean(SD)37.65(23.37)37.57(23.26)Female,number(%)98(50.77)31(55.36)Bloodgroup(%)A5214(26.92)B6318(28.57)O5517(30.91)AB237(30.43)Transfusionhistory,number(%)186(96.37)56(100)Disease(%)‡AML/CML4615(32.61)ALL/CLL3515(42.86)MDS219(42.86)SAA226(27.27)ITP115(45.46)Otherdiseases606(10)*Treatment(%)Chemotherapy13035(26.92)Immunosuppressiveagents3610(27.78)BMT/HSCT§2711(40.74)*ThereissignificantdifferencesbetweenOtherdiseasesgroupandothergroups(Chi-square,p=0.0035),butnosignificantdifferencesamongAML/CML,ALL/CLL,MDS,SAAandITP.TABLE1:Patientcharacteristicsatstudyentryandthepositive%ofplatelet-specificantibody--JiaY,etal.2014,TransfusMed;24(6):406-410.TABLE2:FrequenciesofHLAandHPAantibodiesAntibodyspecificityNumber%OnlyHLA4173.21OnlyHPA1119.64HLA+HPA47.14Total56100TABLE3:GPspecificityofserawithbroadreactivitiesagainstplateletGPsGPspecificityNumberofseraIIb/IIIa2IIb/IIIa+Ia/IIa10IIb/IIIa+Ib/IX1IIb/IIIa+Ia/IIa+Ib/IX1Total14TABLE4:RelationbetweenrateofimmunizationandpreviouspregnanciesinfemalepatientsImmunizedPreviouspregnancyNoYesNo177Yes7424HLA-I类抗体可以通过两种机制破坏血小板：其一是抗体与血小板表面的HLA-I类抗原结合后诱导巨噬细胞或其他吞噬细胞通过Fc受体将其吞噬；其二是这些抗体中有一类补体结合抗体，能够与补体成分C1q蛋白结合，激活经典的补体级联途径导致血小板直接裂解，同时也能增强表达C1q受体的吞噬细胞对血小板的吞噬作用。补体结合抗体（C1q）在PTR中的作用FontaineMJ,KuoJ,ChenGetal.Complement(C1q)fixingsolid-phasescreeningforHLAantibodiesincreasestheavailabilityofcompatibleplateletcomponentsforrefractorypatients.TRANSFUSION2011;51:2611-2618.输注不同类型相合血小板后的CCI。JackmanRP,LeeJH,PeiR,etal.C1q-bindinganti-HLAantibodiesdonotpredictplatelettransfusionfailureinTrialtoReduceAlloimmunizationtoPlateletsstudyparticipants.Transfusion