拟南芥基因克隆的策略与途径

1拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥〔Arabidopsisthaliana〕是一种模式植物，具有基因组小〔125Mbp〕、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成〔TheArabidopsisGenomicInitiative,2000〕。同时，拟南芥属十字花科〔Cruciferae〕，具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。基因(gene)是遗传物质的最根本单位,也是所有生命活动的根底。不管要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。1、图位克隆Map-basedcloning,alsoknownaspositionalcloning,firstproposedbyAlanCoulsonoftheUniversityofCambridgein1986,Geneisolatedbythismethodisbasedonfunctionalgenesinthegenomehasarelativelystableloci,intheuseofgeneticlinkageanalysisorchromosomalabnormalitiesofseparategroupswillqueueintothechromosomeofaspecificlocation,Byconstructinghigh-densitymolecularlinkagemap,tofindmolecularmarkerstightlylinkedwiththeaimedgene,continuedtonarrowthecandidateregionandthenclonethegeneandtoclarifyitsfunctionandbiochemicalmechanisms.图位克隆〔map-basedclonig〕又称定位克隆〔positoinalcloning〕，1986年首先由剑桥大学的AlanCoulson提出。用该方法别离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用别离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的根底上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并说明其功能和生化机制。用该方法别离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传根底。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了〔图1〕。墨目前征完成毛整个形拟南凑芥的荷图位友克隆宫过程烘大约痰需要察一年菊时间锈。在骗这个向过程烘中，坛我们畏从筛陶选突神变体姻开始布，逐绢渐找虚到和教表型认相关移的基浴因。走这和计反向艳遗传泡学炮〔峡re山ve填rs相e逆ge方ne别ti娃cs咏〕许的方加法正拢好相路反。再图位随克隆咐能实年现，爪关键什在于谎全基提因组龄测序摩方案杠的完竿成和鹿各种棚分子港标记档的发滩现。寒这些口数据何被储振存在漂专门铁的数美据库喝中〔我表哀1姐〕〔青Lu陕ko什wi缠tz收等，详2窗00诱0辰〕。漂表繁1昨拟南态芥网歼络资肺源藏网站朋网址蒙Su枯pp承le是me边nt达al军m买at妹er圾ia该l映fo汁r阶th恢is存p蚂ap届er稳No校tt恋in召gh庄am编S鞭to茂ck习C隶en警tr岸e灿〔联U.呀K.薪〕礼Re于co继mb奸in迎an贝t宗In余br询ed似m胸ap托交Oh台io迈S母to成ck造C着en卵te缠r裁〔屈U.辰S.市A.碑〕顾TA水IR但d遍at蹦ab坛as峰e*捕，奉h趣om赶ep哈ag援e木Re狠co缴mb武in疏an呼t级In沫br孤ed密m劳ap网〔青mi翻rr堆or另s泉it抚e怒〕贩CA帐PS睁m除ar旁ke生rs陆讯h流tt鬼p:组//勾Se记qu总en袋ce武t盗ab血le店宣SN吐P猜co宪ll不ec喝ti团on经吉CE贷RE筑ON骆c拔ol渣le遇ct悄io截n逃of毫p李ol苦ym乞or煎ph隐is远ms讯拣SS剖LP遥m调ar伶ke固rs添TI抖GR秃，崇g结en腊om主e允an侵no嗓ta旧ti敲on约s穗Da株ta台ba孝se纺o输f销Le锐r寸se疑qu未en主ce隐s扇Ka假设su证za乡D旋NA节R或es劝ea扣rc辰h湾In稍st垫it苏ut果e岗，卡g菌en城om顽e均an睡no矮ta和ti肃on炮s能MI荡PS理g洁en蚀om评e稿an银no解ta挥ti游on叮s歌sv呆r.斗mi犯ps平.b冈io颤ch帖em裁.m捡pg筐.d扎e/功pr忌oj流/t午ha慨l/教SI扎NS弃d给at命ab西as慕e笛of以t宏ra帖ns践po蹦so猛n死in弄se险rt卡io郑ns悲亲*窄注：岔Th驳e赚Ar滤ab逢id巩op迫si床s率In致fo丹rm辟at笑io焦n怖Re窝so偿ur解ce谎哗〔瓣TA谊IR趁〕巧在拟斑南芥茫中的研图位再克隆遇，在壶很大惨程度者上得鸟益于前对者Co侄l-棚0戴生态滥型测爬序的挑完成剖，因导为它荐是在谨研究要拟南驴芥时铅最常绍用的校生态爷型。在实现恩基因歉图位跟克隆找的关师键是析筛选凳与目轮标基苍因连冬锁的丛分子热标记吹。实盛质上座，分才子标灰记是飘一个移特异惭的嫁DN叶A彻片段荷或能铸够检蛾出的单等位略基因喘，对萌其有芦效地腥利用舌即可士到达开图位盗克隆剃基因查之目拦的。俘迄今痒为止锋，已栏有几患十种壳技术三可用拨于分忍子标企记的发筛选即〔请Wa胃ng抱等，页20舱00弱〕。油其中恳最为鸦常用溉的是绢简单乒序列据长度短多态规性〔恐SS耻LP山s销〕和幼单核春苷酸笑多态论性〔布SN币Ps悬〕。辨SS贷LP闷是基称于庙PC岗R让的分范子标榨记，棍在拟片南芥加基因付组中陕有较无多分群布，扁而且施是共端显性鼓的，牙它的珠检测我非常询直接馋，但堤是我希们需从要设淡计引改物来黄检测匙假定资的名SS碰LP愈标记秤；对篮SN顽Ps池标记省的检食测也教比拟肠直接恭，它列是拟础南芥步不同慕生态箩型之愚间基刺因组饿中的栗单个赠核苷隙酸的肿差异数，这夏些差篇别的垮核苷挨酸通割常位蚊于订非候编码吩区域描〔袖Pe漆te焰rs视等，榆2栽00挺3小〕。怖最常站见的现用于诚检测凑SN晚Ps息标记核的方誉法主渔要是拘剪切腹扩增搬多态洗性序就列〔拾CA庙PS线〕，谜它也聚是基急于犯PC誓R韵的。姻另外抵，一撑种更恢为有怨效的葬方法四衍生踩的虽CA尊PS舍〔址dC画AP蹈S饲〕〔导Na选m肾等，袭1遵98饼9铺；大M积ic趴ha奇el异s横和送A蜡ma溉si掌no摇，浪1沫99扬8滨〕可圣把任演何已啊知的甜点突愧变作梳为分幕子标团记，阿只要雁在原PC金R弃是引愤入不非配对腾的引超物，陡使扩镇增的某序列缎在一浴个生茶态型金中具蜓有限喷制性壮酶切黄位点首，而度在另权一生恭态型斯中没贵有，抬以形常成多础态性盗。幅员位之克隆漫法随怜着相念关配群套技容术〔首序列叼数据政库、碎分子啦标记细等〕介的日吼渐成债熟，畏许多刑拟南已芥及伐一些纵农作释物的醒基因雾已被次成功捎的克浙隆〔鲜表撤2蜓〕。余表茫2先用图彩位克餐隆方龄法得与到的殿拟南克芥及格一些随农作夺物的扰基因弯基因挥突变户表型急基因浩同源槐序列车AB筝13考脱落回酸不绒敏感景玉米轿转录法子衫FI玩D3深降低辩亚油恭酸饱微和度色细菌扛去饱勺和酸贫酶丈AX填R1扫生长烧素抗挂性茄泛素闹N相端活绩性酶来ET稻R1龟乙烯滋抗性附双因婶子调衡节子跨AB蛙I1值脱落挣酸不怎敏感拣钙调拉蛋白森磷酸睬化酶冈DE骂T1慕黄化沉损伤猛反响叙新核夺蛋白狂RP歉S2久抗病萍新型跌富含殿亮氨行酸的灭蛋白烦酶厉RP售M1恋抗病垒激酶吊RS界W1娘纤维奥素合嘉成酶辩细胞柔色素陷P4庭50胖播家系加ZL抖L欲调节部中茎假设分生鲁细胞视胚胎出发育脚蛋白滤PR痒T1克抑制民胞间毅蛋白蠢降解煎控制宿植物菊N慰端代饿谢窜To塔rn吸ad蛛ol圾植株茅短化嘉——毅IF称L1箱正常降的维车管束梨间纤住维分蹈化受拿阻熟亮氨右酸拉住链蛋渡白海AR缺A1凳树胶因醛糖挨激酶鲁活性智丧失馋半乳恰糖激玩酶基指因家略族宴VT弊C2纱维生拜素垄C石合成衣缺乏逼果蝇俱蛋白距CG景35谷52授，线熔虫蛋灿白脊C1淡0F收3.草4贷〔功筝能未蚊知〕团AS泛T污种皮位花青蜜苷斑枕点态花青笔苷生贤物合骗成途文径中刺的二任氢黄失酮醇海-4兆-观复原次酶甚本文嘱拟对疑图位堪克隆池的研淘究进坐展做该一介笼绍，恢以期脏对植恐物遗闭传育肯种和干分子矩生物搞学研景究有提所帮锣助幅。唯2呀图位洗克隆估的一元般过外程值因为贷有了扶拟南箱芥的努基因屡组序但列和谁高密撑度的拆遗传拿标记蜻，图乡位克干隆过复程就看变得王相对展直接氏。图脉2把例举馅了一钞种高协效的耐拟南功芥图妹位克撕隆方响法。形从基鸭于铃Co钞l-检0慈和屋L榨er致遗传斜背景冰的突密变体落出发牺，我身们有狭可能勤在大眯约一堡年时秋间内志找出靠与这惑个突地变相商关的罚基因饺，这分其中亚主要垒耗时车间的夫是五门个植挥物〔怠拟南样芥〕列的生辜长周鸽期〔焦我们辫假定银每个糖周期柏为两各个月足〕。艇作为贯作图茎过程穴的第旦一步据，突扣变体友植株翻将和忌另外随一个殖生态疲型〔食Co喘l-只0禽或者惹L壶er嚼〕的捐植株拖杂交饱。在诱大多死数情台况下逃，用概于杂恳交的雪突变讽体植毫株是痒作为冈父本穷还是汪母本必是没绢有关忍系的蚕。然毙后播鞠种动F1款代种厨子。柳在遥F1跨代植短物的楚生长箩过程牲中，叠我们洽就有掠可能皮来对停其表赵现型椅和基肢因型告进行第分析尸。加F1功代植扁物的男表型炸的出采现或牺者消趟失将惭显示妥着我贱们所浊研究但的突贯变是皮显性糟的还弊是隐追性的续。最恶好通培过对筛一些伯标记况的分燃析来艳确认通F1煎代植忆物是妹杂合捡体，勾而且朽在杂呆交过姻程中嗓我们惹没有爬犯错饱误。座当然鱼也有诵必要粗确认寇原来汗的生哀态型吩背景裂。紧图波2跌图位使克隆连过程拖示意搂图〔刮Ja骡nd许er却等，君2争00喝2递〕灵F1肺代植器物自醉交得射到康F2最代种闭子，培大约倡播种域60睬0健个个深体以抬进行杰突变薄基因哄的粗冷定位片〔桐fi怠rs杯t-较pa射ss疤m滩ap灾pi餐ng汇，图易2舞〕。头在其暗生长绪过程盘中，店我们偶可确估定其隶表型锣，大皱约有股15才0葛个个另体被拥认为拨是纯具合体肥〔在筝隐性亭突变脸的情丑况下纲是纯队合突讯变体和，在弱显性错突变乒的情难况下筝是纯龙合野躬生型柱〕。蝴然后慧从这灭15堆0脚个个厦体的糠叶子千或者鸟其它痰组织值中制挑备膝DN初A郑用于以基因额型分殖析。庆起先糖用分念布于书拟南街芥五游条染河色体考上的盆25吵个标艰记〔糖相邻迷的两万个标按记之添间大金约相斜距肥20势c庆M警〕进修行分辽析，吉确定过突变意基因将是和选哪个衣或者机哪几索个标涨记是雨连锁旦的，本然后羽用三丧点测调交的厚方法山来定塞义一葵个包钢含突扛变基投因的元大约贸20稻c栋M昨的遗剃传间兼隔。途一旦压这样每的一乌个遗样传间卷隔被钥定义即之后怜，接支下来沈的工章作就昼是引她入新屋的标迹记把泊这个妇间隔塘缩小告到大内约横4纳cM呜。一退般来戚说，阀利用倾15迅0膀个度F2战代个感体是成在很蒜大程触度上虑能找虾到这单样一孙个遗蝇传间俭隔的蝶，距扯离突互变基午因最储近的淋两个凉分子啄标记腰将作器为侧骡面标庙记而棕用于哪下面云的进摆一步烂分析赢。受下一掏步我松们将求播种私一个让更大耐的折F2舍代群乎体用榨于突渔变基营因的粉精细厕定位妹〔冻fi费ne鹅-r弄es迹ol拿ut隶io焰n亲ma耻pp渠i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