正交实验法优选地黄中梓醇的提取工艺

正交实验法优选地黄中梓醇的提取工艺【摘要】目的优选出地黄中梓醇的最佳提取工艺。方法以梓醇含量为指标，利用L9正交实验法，以乙醇浓度、提取次数、加醇倍数、提取时间为因素，每个因素取3个水平，进行实验，来确定最佳制备工艺。结果最佳工艺为12倍量95%乙醇提取2次，1h/次。结论经优化后工艺条件可靠，适合地黄中梓醇的提取工艺的参考。

【关键词】地黄；梓醇；正交实验

Abstract：ObjectiveToexploreanoptimumextractiontechnologyofCatalpolfromRehmanniaglutinosaLibosch.MethodsUsingcatalpolastheindex,theeffectsofalcoholconcentration,extractiontime,solventamountandextractiondegreeonextractiontechnologywereevaluatedbyorthogonalsuperiortechnologyofcatalpolwasasfollows:95%alcohol,1hour,12foldsolventandextracted2optimumextractionprocessisstableandaccurate,anditissuitableforextractionofcatalpolfromRehmanniaglutinosaLibosch.

Keywords：RehmanniaglutinosaLibosch；Catalpol；OrthogonalDesign

生地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch的干燥块根，系常用的补药，临床应用十分广泛。传统医学认为地黄具有滋阴补血、生津的功效。生地黄的主要活性部分是环烯醚萜苷类，而环烯醚萜苷类中含量最高的是梓醇。现代研究证明梓醇具有降血糖［1］，预防治疗哮喘病，治疗乙型肝炎病毒感染，对缺血再灌注受损神经元有保护作用［2］，抗癌［3］等药理作用。目前梓醇的开发是一个热点，但由于梓醇化学性质不稳定，易受酸碱［4］等条件影响，这为梓醇的提取增加了难度，本实验对回流提取、超声提取、40℃温浸3种提取方式及甲醇、乙醇和水的提取溶媒进行了筛选，在此基础上，利用正交实验，以梓醇含量和干浸膏的重量为指标优选出最佳工艺。

1仪器与试药

LC-10vp高效液相色谱仪，日本岛津公司生产；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声波仪器公司生产；A240型电子天平，美国梅特勒公司生产；恒温水浴箱，北京市永光医疗仪器厂。生地黄，产自河南省武涉县西陶镇，由锦州奥鸿药业有限责任公司质量部照2005年版《中国药典》Ⅰ部地黄质量标准检验，符合规定。梓醇对照品，批号110808-200407，购于中国药品生物制品检定所；乙腈，美国Fish公司生产；其余试剂为国产分析纯。

2方法

1梓醇的含量测定

色谱条件色谱柱：日本岛津VP-ODS柱，mm×150mm；流动相为乙腈∶%磷酸；流速：ml·min-1；柱温：36℃；检测波长：214nm。

对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的梓醇对照品mg，置1ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用。

供试品溶液的制备取地黄样品适量，粉碎，过2号筛，精密称定100g,加入95%乙醇1000ml，回流提取2h，滤过，将滤液减压浓缩至干加100ml水溶解，用μm滤膜滤过，取续滤液即得。

梓醇标准曲线绘制分别精密称取梓醇对照品加水配制浓度分别为，，，，mg·ml-1，按色谱条件，分别进样10μl对照品溶液，测得峰面积，以对照品重量为横坐标，以峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：Y=806095X+106，r=6。结果表明梓醇在～mg·ml-1时进样量与峰面积呈良好线性关系。

精密度实验取同一对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，每次10μl，测定梓醇峰面积，其RSD为％，表明该法的精密度良好。

稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，24h，按上述色谱条件，进样10μl，测定梓醇峰面积，RSD为%，表明梓醇在24h内稳定。

重复性实验取同一批地黄样品6份，按“”项下方法制样后，以上述色谱条件，进样，测定梓醇的峰面积，按外标法计算含量，RSD为%，表明分析方法重复性良好。

加样回收率实验精密称取已知含量的生地黄提取液10ml，分别定量加入梓醇对照品，计算回收率(见表1)。平均回收率为%，RSD为%。

结果表明本方法具有良好的回收率。以上实验表明该方法测定梓醇准确可靠。

提取工艺的优化

优选实验方法和溶剂文献报道梓醇的提取方法有回流提取、超声提取、冷浸法等，本实验分别考察3种方法和3种溶剂在提取过程中对梓醇提取率的影响。

表1回收率实验结果

实验方法：取生地黄样品粉碎，过2号筛，称取9份样品，每份10g，将9份样品分成3组，每组分别加入100ml水、100ml95%乙醇、100ml甲醇，将第1组分别超声提取70Hz，20min，第2组回流提取2h，第3组40℃温浸6h，分别过滤取滤液减压浓缩至干，分别加入10ml水溶解，滤过，取滤液液相检测梓醇含量，并计算干浸膏的重量。结果见表2。

表2不同提取方法不同溶剂提取后测得干浸膏重量和梓醇含量

由表2可见回流提取方法优于其他两种方法，在溶剂方面虽然甲醇的提取率高，但是干浸膏重量大，即杂质含量高，对下一步的纯化带来一定的难度，并且甲醇毒性大，所以最佳的提取方法为乙醇回流提取。

正交实验设计由上述实验选择乙醇回流提取，且对乙醇浓度、乙醇倍数(B)、提取次数(C)、提取时间(D)4个因素进行考察，每个因素设计3个水平，设计L9正交实验。因素水平表见表3。

表3因素水平

实验方法及结果称取粉碎后的生地黄药材9份，每份100g，按表4的设计进行回流提取，每次提取1h，合并滤液，放凉后滤过，减压浓缩至干，称量干浸膏的重量，向干膏中加100ml水溶解，用μm滤膜滤过，取滤液按梓醇含量测定项下测定。

正交实验结果分析结果见表5。直观分析表明，干浸膏得率极差大小为ACBD，较好工艺组合为A3B2C1D3。梓醇含量极差大小为ACBD，较好工艺组合为A3B3C2D1。方差分析的结果表明，因素A对整个实验验结果影响最大，以后依次为C、B、D。因素A对试验结果具有显着意义，A3提取效果最好，提取率高，宜选择A3；因素B、C、D对干浸膏重量和梓醇含量无显着性影响。故从干浸膏重量最小梓醇含量高两方面考虑，确定生地黄提取工艺条件为A3B3C2D1，即12倍量95%乙醇提取两次，1h/次。

验证实验根据上述结果筛选的工艺重新进行实验，进一步验证前面工艺的正确性。提取率在80%以上。

表4正交实验设计及实验结果

表5方差分析

3讨论

通过对超声提取、室温浸出提取、回流提取3个提取方法的考察得出了回流提取梓醇含量高。在溶剂选择方面分别对水、甲醇、95%乙醇3种溶剂进行了考察，在干浸膏重量上95%乙醇低于其他两个溶剂，分析可能由于大量的糖类、氨基酸等水溶性杂质不能被乙醇提出来的缘故［5］。这样对后期梓醇的纯化带来很大的方便。在此基础上我们采用了正交实验对不同的乙醇浓度、提取时间、提取次数、提取溶剂倍数。分别选择了3个水平分别进行考察。得出了乙醇浓度对干浸膏和梓醇含量影响较显着。有文献对地黄中梓醇变化的条件进行研究，结果表明，梓醇溶于水中加热100℃10h后，其含量未见明显变化；但在酸、碱条件下极不稳定。因此实验所确定回流提取工艺对梓醇含量不会有影响，而且较适合工业生产，对梓醇提取的工业化提供了一定的技术参数。

【参考文献】

［1］万昌武,张雅丽,桂华珍,等.地黄不同方法提取物制剂降糖作用的实验研究［J］.贵州医药,2003,27(12):1112.

［2］李杨,李丹清,包永明,等.梓醇对缺血再灌注受损伤神经元保护作用的研究［J］.中国现代医学杂志，2005,15:1454.

［3］PungitoreCR,AyubMJ,BorkowskiE