左旋咪唑诱导实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠脊髓内单个核细胞上CD4-CD28和CD152表达的实验研究

左旋咪唑诱导实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28和CD152表达的实验研究【摘要】目的观察左旋咪唑对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28和CD152表达的影响，并探讨LMS诱发炎性脱髓鞘白质脑病发病机制。方法采用流式细胞术检测EAE大鼠脊髓单个核细胞上CD4，CD28和CD152的表达水平。结果LMS同时给药组和预处理的EAE组大鼠脊髓内单个核细胞上CD4和CD28的表达水平，均明显高于非LMS处理的EAE模型组。结论LMS能促进EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4和CD28的表达，提示LMS上调CD4和CD28的表达与可能LMS诱发的炎性脱髓鞘白质脑病有关。

【关键词】左旋咪唑实验变态反应性脑脊髓炎

Abstract：ObjectiveToobservetheeffectoflevamisole(LMS)onexpressionsofCD4,CD28andCD152onmononuclearcellsinspinalcordsofratswithexperimentalallergicencephalomyelitis(EAE),andstudythepathogenesisofinflammatorydemyelinatingleukoencephalopathyinducedbyLMS.MethodsUsingflowcytometry,wedetectedlevelsofCD4,CD28,CD152inmononuclearcellsinspinalcordsofEAEexpressionlevelofEAEratstreatedwithLMSshowedhigherthanthatofratstreatedwithoutcouldexacerbateEAEbyenhancingtheexpressionsofCD4andCD28inspinalcordsofEAErats,andup-regulationofexpressionsofCD4andCD28mayplayacrucialroleininflammatorydemyelinatingleukoencephalopathyinducedbyLMS.

Keywords：Levamisole;Experimentalallergicencephalomyelitis

左旋咪唑(Levamisole,LMS)为四咪唑的左旋异构体，是国家和WHO抗蠕虫病基本药物，作为广谱驱肠虫药使用于。1971年，Renoux发现LMS具有增强免疫的作用,其作为免疫增强剂被推广用于慢性感染、皮肤疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等疾病的免疫调节辅助治疗，长期以来被认为安全低毒。但近二十年来，国内外发现LMS能导致严重的中枢神经系统功能障碍—左旋咪唑性白质脑病。LMS与LMS性白质脑病的因果关系，已被系统的药行病学研究所证实报道的标准，定为0～5分：无明显异常者为0分，尾巴无力者为1分，轻微后肢无力者为2分，严重后肢麻痹者为3分，四肢麻痹者为4分，死亡者为5分。

大鼠脑、脊髓的病理检查

将SD大鼠以100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后,用300ml预冷的GKN液(8g/LNaCl，g/LKCl，g/LNa2HPO4·12H2O，g/LNaH2PO4，H2O，2g/L葡萄糖及2000U/L肝素，pH)经主动脉灌流至无血液流出时，小心取出脊髓及脑。取一小段颈髓及部分脑组织依次经40g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋及常规苏木素-伊红染色(切片厚5μm)和LuxolFastBlue髓鞘染色(切片厚10μm)后，在光学显微镜下进行病检查。

脊髓单个核细胞上CD4，CD28及CD152表达的检测按Pope等［3］报道的方法制备脊髓单个核细胞，并调整细胞数为5×109/L。于100μl单个核细胞中加入不同荧光素标记的抗CD4，CD28及CD152抗体各μg避光孵育30min，用PBS清洗1次，再加入10g/L多聚甲醛200μl待测。同时在含有100μl单核细胞的另1管中加入三种具有相对应荧光标志的小鼠IgG1抗体避光孵育作为阴性对照。最后上流式细胞仪检测，用Cell对获取的结果进行分析,每份样品分析20000个细胞，减去阴性对照的结果后，以CD+4，CD+28，CD+152细胞数的百分比表示CD4，CD28，CD152的表达水平。

学处理

各种检测所获数据均以±s表示，组间比较采用方差分析(One-WayANOVA)。大鼠的发病率采用Chisquare检验，所有数据均采用SPSS11.5统计软件进行处理。

3结果

SD大鼠的发病及神经受损情况

对照组大鼠未出现症状，体质量持续增长，活动度正常。第1，2组(即LMS同时给药组和LMS预处理组)、第3组(EAE模型组)大鼠于免疫后12d，开始陆续发病。发病前2～3d，出现进食减少、体重下降、毛发失去光泽甚至竖毛，并出现尾巴无力、瘫痪,继而后肢无力及瘫痪；多伴有大小便失禁，部分累及前肢。第1，2组大鼠的病情进展快，神经功能损害重，平均最大评分明显高于第3组；但发病率和发病的潜伏期无统计学意义。各组大鼠的发病及神经受损情况见表1。表1SD大鼠EAE的发病情况及症状评分

病改变对照组大鼠脑及脊髓的病理检查，未发现炎性细胞浸润及脱髓鞘改变。EAE模型组大鼠的脑及脊髓实质内，小血管周围有较多的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，典型者呈血管袖套样改变，髓鞘染色发现局灶性脱髓鞘。LMS同时给药组和LMS预处理组中炎性细胞的浸润及脱髓鞘改变更明显，可见到较多的血管袖套样改变，神经细胞肿胀、变性、坏死，并可见胶质细胞增生、小结节形成等。

EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28，CD152的表达EAE模型组SD大鼠脊髓内单个核细胞上CD4的表达最高，CD28的表达也较高，而CD152的表达水平最低。LMS同时给药组和LMS预处理组大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28的表达水平较EAE模型组明显增高，有显着统计学差异；而CD152的表达无明显变化见表2。表2EAE大鼠脊髓单个核细胞上CD4，CD28及CD152的表达

4讨论

EAE是CD+4T细胞介导的自身免疫性疾病。T细胞的活化需要两个刺激信号：第1信号为T细胞表面的TCR/CD3复合物与抗原提呈细胞上MHC-Ⅱ类抗原及抗原肽相结合；第2信号又称协同刺激信号，为T细胞上的协同刺激分子与APC表面的配体相结合所提供。虽然还有4-1BB等其它协同刺激分子参与T细胞的活化和增殖，但CD28是诱导T细胞的活化的重要协同刺激分子，而且可能优先诱导CD4+T细胞活化。CD28/B7协同刺激途径激活可明显促进IL-2合成，上调抗凋亡分子Bcl-xL，促进T细胞活化,促进EAE的发病。CD28-/-或CD28肽类似物可干扰其与配体结合明显抑制EAE的发病［4］。

我们发现，急性EAE大鼠病理改变主要为脑、脊髓实质内小血管周围炎性细胞的浸润，典型者呈血管袖套样改变，髓鞘染色可发现局灶性脱髓鞘。脊髓提取的单个核细胞(主要为淋巴细胞)中以CD4+细胞为主，支持EAE主要为CD4+T细胞介导的以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。在给予GPSCH-CFA致敏的基础上，同时给予10mg/kg的LMS后可明显加重EAE大鼠的症状，平均最大评分明显增高(P＜0.01)。本研究首次发现，给予LMS预处理也能加重EAE大鼠的症状和病理改变。LMS同时给药及LMS预处理组均可明显促进SD大鼠EAE急性期脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达，而对CD152的表达无明显影响，故CD4+/CD152+细胞的比值升高。与EAE模型组相比较，LMS同时给药组及LMS预处理组大鼠中CD28+和CD4+细胞数增加近1倍，与其神经受损的情况及病理改变相一致。LMS作为一种免疫刺激剂，能诱导T细胞活化，增加CD4的表达，提高细胞免疫水平［5］。CD28表达的增加，通过CD28/B7-1或B7-2协同刺激途径，可促进更多T细胞活化增殖，减少其凋亡，并促进其分泌更多的促炎细胞因子(如IL-2)等，进一步加重EAE的炎症过程。

以上表明，LMS能上调急性期EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达，提示其在中枢神经系统自身免疫性疾病中具有增强免疫病理的作用，可能是其诱发炎性脱髓鞘白质脑病发病机制中的重要环节。

【参考文献】

［1］周元瑶.药行病学［M］.北京:中国医药科技出版社,1996:400.

［2］KonoDH,UrbanJL,HorvathSJ,etal.TwominordeterminantsofmyelinbasicprotninduceexperimentalallergicencephalomyelitisinSJL/Jmice［J］.JExpMed,1988,168(1):213.

［3］PopeJG,KarpusWJ,VanderlugtC,etal.FlowcytometricandfunctionalanalysesofCNS-infiltratingcellsinSJL/JmicewithThler‘svirus-inducceddemyelinatingdisease:evidenceforaCD+4Tcell-me-diatedpathology［J］.JImmunol,1996,156(10):4050.

［4］SrinivasanM,GienappIE,StuckmanSS,etal.Suppressionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisusingpepti