两种配制方法对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型的影响

两种配制方法对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型的影响【摘要】目的评价两种配制方法对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型的影响，选出更稳立的造模方法。方法将雄性wister大鼠30只随机分为三组，正常组、模型［组，模型2组，每组10只。模型组用1%DMN腹腔注射，lml/kg,每天一次，每周连续三次，共四周；正常组予同等剂量的生理盐水腹腔注射。模型1组注射的DMN为一次性配制，模型2组注射的DMN为注射当日配制。第四周末处死所有大鼠。留取血淸测ALT.AST,留取肝脏组织分别行Masson染色、肝纤维化半左量评分、疑脯氨酸含量。结果1)实验结束时，正常组及模型2组大鼠存活率100%,模型1组大鼠存活率40%。2)两模型组ALT比正常组明显升髙(P<0.05),模型1组比模型2组明显升髙(P<0.05):两模型组AST较正常组明显增高(P<0.05)，模型1组较模型2组明显增髙(P<0.05).3)模型1组大鼠肝纤维化半泄量评分比模型2组明显增髙(PV0.05)。4)两模型组疑脯氨酸含虽:均比正常组明显增高(P<0.05),模型1组较模型2组明显增高(PV0.05)。结论DMN一次性配制与每次注药前新鲜配置相比，前者毒性更强，大鼠死亡率较高，肝功能损害更严重，肝纤维化更重，基本都达到肝硬化。后者逍模更稳怎，大鼠死亡率低，利于肝纤维化的发生机制及筛选治疗药物的研究。【关键词】二甲基亚硝胺；肝纤维化TheimpactionoftwomethodsforliverfibrosismodelinducedbydimethylnitrosamineOuyangYan,LiuYuehui»ZhouZhengwen(Departmentofgastroenterology.Thethirdhospitalofchangsha»Changsha,410015)Abstract：ObjectiveToevaluatetheimpactionoftwomethodsforliverfibrosismodelinducedbydimethylnitrosamine♦toselectthemorestablemethod.Methods30healthymaleWisterratswererandomlydividedinto3groups(10ineverygroup):normalcontrolgroup：model1group：model2group.Hepaticfibrosiswasinducedbyintraperitonealinjectionsoflml/kgof1%DMN»administered3consecutivedaysaweekfor4weeks<normalgroupwereintraperitonealinjectionsofsalineascontrol.The1%DMNofmodel1groupwasone-timepreparation,andthe1%DMNofmodel2groupwasfreshpreparation.AllRatswerekilledafter28daysoftreatment.TheirbloodserawereusedformeasuringALTandAST.andtheirlivertissuewereusedfor：(1)observepathologicalchangeofliverandmakesemiquantitativescoreofhepaticfibrosis：hydroxyprolinemeasurementtodetectcollagencontentsofliver.Result1)Attheendoftheexperiment,thenormalgroupandmodelgroup2ratsurvivalrate100%>model1groupratsurvivalrate40%.2)ALTinbothmodelgrouparehigherthannormalgroup(P<0.05),themodelgroup2comparedwiththemodel1groupsignifiedntlyincreased(P<0.05)・ASTinbothmodelgrouparehigherthannormalgroup(P<0.05),themodelgroup2comparedwiththemodel1groupsignificantlyincreased(P<0.05).3)Liverfibrosissemi-quantitativescoreofthemodelgroup1ishigherthanthemodelgroup2(P<0.05)・4)Hydroxyprolinecontentinbothmodelgrouparehigherthannormalgroup(P<0.05),themodelgroup2comparedwiththemodel1groupsignifiesntlyincreased(P<0.05)・ConelusionDMNone-timepreparationcomparedwithfreshpreparation»theformermodeismoretoxic,highermortality,moreserious,moresevereandbasictocirrhosisoftheliver.Thelattermodeismorestable,lowermortality,andgoodforthemechanismofliverfibrosisandscreeningofdrugresearch・Keywords：dimethylnitrosamine(DMN),hepaticfibrosis肝纤维化是肝细胞发生炎症坏死时，肝内纤维结缔组织异常增生，它不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病(如病毒性肝炎、洒精性肝病、非洒精性脂肪肝等)的共同病理过程⑴，若进一步发展引起肝小叶改建、假小叶和结节形成，则进入肝硬化。肝硬化在全球致命疾病中排名第八位，肝硬化是不可逆的，唯一有效的治疗方法是肝移植［2］,而其中间阶段肝纤维化是可逆的［3］,积极探索防治肝纤维化的有效措施，对延缓慢性肝病的发展意义重大。因此,如何有效地防治肝纤维化，阻断英进展，已经成为国内外研究的热点。为了研究肝纤维化的发生机制并筛选出有效的治疗药物，需要建立良好的肝纤维化动物模型。二甲基亚硝胺（DMN）诱导的肝纤维化其机理主要与毒性产物引起核酸与蛋白质的甲基化从而导致肝细胞坏死有关⑷。连续腹腔注射DMN后，大鼠肝内岀现小叶中心出血性坏死改变，伴炎性单个核细胞浸润和肝内细胞增生（以成纤维样细胞增生为主），逐渐发展成纤维化⑸。该模型成功率髙，适模周期短，可重复性强，死亡率底，肝纤维化形成相对稳左，且与人类肝硬化早期改变及胶原纤维沉积相似，是比较理想的肝纤维化模型，可作为筛选抗纤维化药物［4］“但在文献报道中DMN致大鼠肝纤维化的剂量难以掌握［6-7］,我在实验中发现，不同的配药方法对结果的影响也较大，本实验比较两种配制方法对肝纤维化成模的影响。材料与方法实验材料与方法1.1材料1.1.1实验动物：雄性wister洁级健康大鼠30只.购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体重180g-220g,6周龄。适应性喂养一周后体重在在200〜250g。1.1.2实验仪器：光学显微镜、髙效液相色谱紫外检测仪、全自动生化分析仪。1.1.3实验试剂:二甲基亚硝氨［DMN（CH3）2NNO］：购于TCIAMERICA（批号FiNOl）,纯度95%（GC）.1.2实验方法1.2・1动物实验：二甲基亚硝胺（DMN）诱导肝纤维化大鼠模型的制备及动物分组：将30只大鼠分为三组，正常组、模型一组，模型二组，每组10只。模型一组，注射的DMN为一次性配制，方法为将ImLDMN（浓度为lg/ml）溶于100mL无菌的生理盐水中，配成1%的浓度，避光密闭放于冰箱中。称大鼠的体重，按ImL/kg,给予大鼠腹腔注射［8］。模型二组注射的DMN也是溶解于生理盐水中，浓度也是lg/ML.为注射当日配制。造模方法：模型组用1%DMN腹腔注射，lml/kg,每天一次，每周连续三次，共四周：正常组予同等剂量的生理盐水腹腔注射，每天一次，每周连续三次，共四周，第四周末处死所有大鼠［9］。10%水合氯醛（0・709ml/100g）腹腔麻醉后心脏取仏取出的血液装入促凝管中，3500rpm离心5分钟，取上淸，做肝功能检测。取岀肝脏后用预冷的生理盐水冲洗，左肝远端留取病理组织,大小约l*0.5*0.3cm,10%中性福尔马林固定,另部分分装入EP管中,液氮速冷后・70度冰箱保存.留做耗脯氨酸检测。1.2.2病理学检査：肝脏中性甲醛固泄6・24小时，常规脱水石蜡包埋，待做HE染色、Masson染色，依照1994年法国Chevallier等首次提岀的将纤维化的形态结构与数量相结合的半左咼评分系统（SSS）,将纤维化分成中央静脉周围、実周、汇管区及纤维隔四项，分别依轻重程度计分［10］c对大鼠肝脏纤维化计分。1.2.3肝功能检测：采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）。1.2.4疑脯氨酸测泄：采用高效液相色分析法。1.2.5统计学处理：计量资料采用平均值土标准差表示,用SPSS13.0统计软件进行统计分析，方差齐用一维方差分析，方差不齐用秩和检验，P<0.05认为有统计学意义。二、实验结果2.1大鼠状态及死亡情况正常组一般情况良好，体重逐渐增长，实验结束时较实验开始时平均增长近100g,10只均存活。模型1组共10只，大鼠状态差，体重不增长，实脸过程中死亡6只，因状态欠佳，第四周仅注射两次DMN.并提前两天处死剩余4只。模型2组共10只，实验过程中大鼠状态较正常组欠佳，体重不增长，至实验结束时体重还略下降，但均存活。2.2大体标本结果(图1)正常大鼠肝脏表而光滑，颜色暗红，质软。模型1组大鼠肝脏明显缩小，颜色偏黄，肝脏表而不光滑，质硬或质韧。模型2组模型组：肝脏色暗红，缩小，表而颗粒感，边缘钝，质韧。三、讨论肝纤维化的实质是肝脏的损伤与愈合反应过程，其结果是肝脏的细胞外基质(ECM)的产生超过其降解，从而使过多的ECM沉积在肝脏组织中，导致肝脏正常结构的破坏与重构及肝功能的损伤[11]，DMN诱导的肝纤维化其机理主要与毒性产物引起核酸与蛋白质的甲基化从而导致肝细胞坏死有关[4]。连续腹腔注射DMN后，大鼠肝内出现小叶中心出血性坏死改变，伴炎性单个核细胞浸润和肝内细胞增生(以成纤维样细胞增生为主)，逐渐发展成纤维化[12]。该模型成功率髙，，造模周期短，可重复性强，肝纤维化形成相对稳泄，且与人类肝硬化早期改变及胶原纤维沉积相似，是比较理想的肝纤维化模型。但在文献报道中用DMN诱导肝纤维化的实验中，所用的剂量差异较大，时间也不一致，所以在综述中评价该模型的缺点是剂量不易掌握，本实验中发现DMN一次性配制后放冰箱保存.和每次注药前新鲜配宜对肝纤维化模型造模影响较大，前者明显毒性更强了，大鼠死亡率髙，肝功能损害更严重,肝纤维化更重.基本都达到肝硬化。原因还未探明，是不是前者配制时间较长，DMN分解为别的毒性更强的物质，还是放宜过久，导致溶液污染在造模过程中感染大鼠，还需要进一步研究检测以确左。后者造模明显更稳定，在后续的实验中也证实重复性较好，成模需要的剂量及时间比较稳立，大鼠死亡率低，利于肝纤维化的发生机制及筛选治疗药物的研究。科研之路艰辛，实验中一个小小的条件改变，就可导致实验结果相差很大，每一个科研成果，都凝结着科研人员的汗和泪。参考文献：GressnerAM,WeiskirchenR.ModernpathogeneticconceptsofliverfibrosissuggeststellatecellsandTGF-pasmajorplayersandtherapeutictargets[J].JCell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