海藻酸钙固定化葡萄糖淀粉酶的研究毕业设计(论文)

毕业设计（论文）绪论1.1葡萄糖淀粉酶的简介1.1.1葡萄糖淀粉酶的性质葡萄糖淀粉酶是由微生物分泌的一种具有外切酶活性的胞外酶，在工业中广泛应用，作用重要，在葡萄糖制造、酿醋、酿酒、有机酸、氨基酸等工业中应用广泛。葡萄糖淀粉酶的底物专一性比较低，可以将淀粉百分之百水解，生成的产物为葡萄糖[1]。葡萄糖糖淀粉酶随作用的温度升高其酶活力逐渐增大，当超过65℃时又随着温度的升高酶活力急剧下降，其最适最适作用pH在4.0-4.5左右[2]。1.1.2葡萄糖淀粉酶与淀粉的反应葡萄糖淀粉酶，又称糖化酶(EC..)，它能从淀粉的非还原性未端将α-1，4葡萄糖苷键水解产生葡萄糖，也可以缓慢水解α-1，6葡萄糖苷键，生成葡萄糖。同时也能水解糊精、糖原的非还原性末端释放出β-D-葡萄糖。1.1.3葡萄糖淀粉酶与α-淀粉酶葡萄糖淀粉酶是外切酶，依次从淀粉分子非还原端切割α-1，4葡萄糖苷键和α-1，6葡萄糖苷键，逐个切下葡萄糖残基，有一定的次序性，水解后产生的游离半缩醛羟基发生转位作用，释放出β-葡萄糖。无论是作用于直链淀粉还是支链淀粉，葡萄糖淀粉酶水解的最终产物均为葡萄糖。α-淀粉酶[3]既作用于直链淀粉，也作用于支链淀粉，它的特点是能够无差别地随机切断糖链内部的α-1，4葡萄糖苷键。水解直链淀粉时最终产物以葡萄糖为主，此外还有少量麦芽三糖及麦芽糖；水解支链淀粉时，除麦芽糖，葡萄糖，麦芽三糖外，还有一定量的α-极限糊精的生成[4]。1.2酶固定化的方法酶固定化方法很多，主要有吸附法、包埋法、交联法、结合法等[5]。1.2.1吸附法吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，所选的载体材料一般为天然或合成的无机、有机高分子材料，例如纤维素、琼脂糖等一些多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等，把酶固定在一种或者多种载体材料上。因为吸附对酶的损害不是很大，尽管酶失活了，也可以重新活化，载体可以再生。吸附法的吸附过程具有双重功效，既可以达到纯化，同时也可以达到固定化的目的。1.2.2包埋法包埋法是将单体与制备好的酶溶液进行混合，再借助引发剂的作用发生聚合反应，将酶包埋在载体材料的网格中，达到固定化的目的。该法的优点是：酶分子或细胞本身没有参加格子的形成，工业生产中的大多数酶都可用这种方法来固定化，并且方法比较简便；酶分子没有受到化学作用，仅仅是被包埋起来了。所以活力较高。此法的缺点是不适用于大分子底物，大分子底物无法进入网格与酶接触。1.2.3交联法交联法是借助多功能试剂使酶分子之间发生交联作用，通过制成的网状结构来将酶固定化的方法。酶分子和有特殊功能的试剂之间形成一种稳定的共价键，酶分子之间能发生交联作用，并且还存在着一定的分子内的交联作用。交联法制备的固定化酶结合较为牢固，适合长时间的使用，但是由于在交联过程中酶分子的多个基团被交联，使得酶活力损失很大。1.2.4结合法结合法是通过酶蛋白分子上的功能团以化学共价键的形式连接到固相支持物表面上的反应基团上，达到固定化目的的一种方法。结合法的优点是酶分子与载体之间通过化学键连接牢固，发生酶的脱落的可能性较小，生成的酶稳定性良好，并且具有较好的重复使用性，缺点是酶与载体的反应条件比较剧烈，酶容易失活，且制备起来比较复杂。1.3载体材料的介绍1.3.1海藻酸钠的性质海藻酸钠是一种高粘性的高分子化合物。它与淀粉、纤维素等的不同之处，是它具有羧基，是β-D-甘露糖醛酸的醛基以苷键形成的高聚糖醛酸。海藻酸钠亲水性强，在冷水中和温水中都能溶解，形成非常粘稠的均匀的溶液。加入葡萄糖淀粉酶溶液之后，形成具有一定的柔软性和均一性的溶液。1.3.2海藻酸钠与氯化钙的反应海藻酸钠的分子链上含有大量的羟基和羧基，将含有葡萄糖淀粉酶的海藻酸钠溶液用注射器逐滴滴加到氯化钙溶液中时，氯化钙溶液充当交联剂的角色。海藻酸钠溶液电解产生海藻酸阴离子，氯化钙产生二价钙离子，钙离子与海藻酸阴离子发生静电作用而吸引，从而团聚沉淀，生成海藻酸钙聚合物[6]。生成的海藻酸钙小球是一种多孔网状的凝胶，由顾旭炯[7]等人的研究可知，葡萄糖淀粉酶分子比海藻酸钙小球上的孔径大，淀粉经糊化后的糊精的分子量比海藻酸钙小球上的孔径小，这样葡萄糖淀粉酶才能很好地固定在海藻酸钙小球内，达到固定化的目的，糊精也能由小孔进入到海藻酸钙小球内与葡萄糖淀粉酶形成酶-底物复合物，并发生反应，生成葡萄糖。这种方法生成的固定化酶制备比较简便，条件也较温和，酶本身的活性损失少。但是，在有多价阴离子的溶液中、高浓度电解质溶液中，海藻酸钙凝胶中的钙离子容易脱落，变得很不稳定，使得形成的凝珠变软，长时间甚至会发生溶解[8]。1.4总体操作流程糖化酶2%的淀粉溶液糖化酶2%的淀粉溶液↓↓缓冲液溶解糊精↓↓海藻酸钠→溶解→混合→造粒→固定糖化酶颗粒→混合→催化反应→葡萄糖图1-1总体操作流程依次研究氯化钙的浓度、给酶量、形成时间对固定化酶的影响，得出固定化酶的性质，包括动力学参数和重复使用稳定性。采用斐林试剂快速滴定、DNS法测还原糖含量两种方法测定酶活力。斐林试剂快速滴定利用的是在碱性条件下，含有自由醛基的还原糖，能将二价铜离子还原成氧化亚铜的性质来进行滴定的。DNS法测还原糖的原理是还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，会产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。1.5研究目的和意义酶在工业中使用广泛，但是游离酶对反应的环境非常敏感，易受到温度、pH、搅拌等作用的影响，酶蛋白容易变性，从而会降低甚至丧失活性。同时，游离酶反应后难于与底物和产物分离，这样不仅会影响生成的产物的纯度，而且酶也很难重复使用，这在很大程度上使酶的应用受到限制[9]。固定化技术的应用，使酶应用过程中存在的很多问题得到解决，为酶的工业应用开辟了新的前景。本次研究的目的是为工业上淀粉一步水解为葡萄糖的生产提供一个可靠的技术支持。选取的是工业上比较常用、价格相对低廉的海藻酸钠作为载体。海藻酸钙固定化葡萄糖淀粉酶是通过将葡萄糖淀粉酶酶包埋于凝胶内使酶分子局限在一个有限的空间内的过程。正如上面介绍的包埋法，葡萄糖淀粉酶的活性中心的氨基酸残基并没有与载体发生作用[10]。固定化酶可以反复使用，酶与底物、产物分离比较容易。与游离酶相比，固定化酶不仅保持了高效、专一及温和的酶催化反应特性，也克服了游离酶的不足之处，具有储存稳定性高、可多次重复使用、操作连续可控、分离回收容易、工艺简便等优点。因为酶经过固定化后，催化活性会有一定程度的丧失，而且，通过包埋法得到的固定化酶容易泄露，包埋在载体内不牢固，并且在反应过程中存在空间位阻的限制，使催化活性不高[11]。所以本次研究是为了确定其最佳固定化条件，检验固定化后的理化性质及稳定性，尽可能降低酶的活性的丧失。使固定化酶能在工业中大规模的使用，为工业生产降低大量成本。2海藻酸钙固定化葡萄糖淀粉酶的方法研究固定化酶的方法多种多样，如侯红萍等人用壳聚糖一海藻酸钠共混凝胶包埋固定糖化酶[12]和采用介孔分子筛SBA-15固定糖化酶[13]，董昭等人采用海藻酸铝固定化糖化酶[14]，郭海学用纤维素载体固定化糖化酶[15]。本文采用的是海藻酸钠包埋法固定化葡萄糖淀粉酶，在郭桥等人的α-淀粉酶和糖化酶的共固定[16]中就是采用的海藻酸钠包埋法，而本次只是单独固定葡萄糖淀粉酶，对其中制备时的三个影响因素，包括给酶量、氯化钙的浓度、形成时间，进行了优化。2.1材料2.1.1实验材料和试剂表2-1实验材料与试剂药品名纯度生产厂家海藻酸钠化学纯西陇化工股份有限公司无水氯化钙分析纯成都市科农化工试剂厂糖化酶活性≧10万/克柠檬酸分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司柠檬酸钠分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心可溶性淀粉分析纯天津市广成化学试剂有限公司硫酸铜(CuSO4·5H2O)分析纯成都市联合化工试剂研究所酒石酸钾钠分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠(片状)分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司次甲基蓝分析纯天津市广成化学试剂有限公司葡萄糖分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司2.1.2仪器与设备表2-2实验仪器与设备仪器名称型号产地电热恒温水浴锅H·H·S21-28上海医疗器械五厂恒温水浴锅B-220上海亚荣生化仪器厂电热恒温干燥箱PH030A型上海一恒科学仪器有限公司循环水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)巩义市予华仪器有限责任公司电冰箱BCD-174博西华家用电器有限公司万分之一电子天平AR2140梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司2.2测定方法2.2.1斐林试剂的标定称取120℃烘干至恒重的葡萄糖配置3mg/ml的葡萄糖溶液。取斐林溶液A、B各5.0mL，置于250ml的锥形瓶中，加10mL水进行稀释，加热使其于5min内沸腾，在沸腾状态下用酸式滴定管滴入3mg/ml的葡萄糖溶液至蓝色即将消失时，加1～2滴次甲基蓝指示液，继续滴定至蓝色消失，记录所用葡萄糖溶液的体积。表2-3斐林试剂的标定编号1234平均值（V1）葡萄糖用量（ml）18.6017.9218.2017.85游离酶活力的测定按参考文献[17]中糖化酶活力测定的方法，也就是用斐林试剂快速滴定法来测定生成的葡萄糖的含量。将糖化酶反应的最适温度和pH下，每小时生成1mg葡萄糖所需的酶量定为一个活力单位，即1IU=1mg/h。游离酶活力的测定：向250mL锥形瓶中加入50mL浓度为2%淀粉溶液，65℃保温10min，然后加入10mL用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.6）配置的一定浓度的酶液，准确反应1h，再放入沸水中煮沸10min将酶灭活，同上述斐林试剂滴定法一样，用反应液滴定斐林试剂，滴定至蓝色消失时，记录所用溶液的体积V。酶活力计算的公式：其中：X为酶活力（U）；V1为标定斐林试剂时所用的葡萄糖的体积，为18.14mL；C为标定斐林试剂时所用的葡萄糖的浓度，为3mg/ml；V总为酶作用的淀粉和缓冲液的总体积，为60mL；V为反应1h后的反应液滴定斐林试剂所用的体积；n为反应液稀释的倍数，当滴定量在15mL以下时应该适当稀释。2.2.3固定化酶活力的测定按参考文献[17],同游离酶活力的测定方法，向250mL的锥形瓶中加入50mL浓度为2%淀粉溶液和10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.6），65℃保温10min，然后加入一定量的固定化酶，准确反应1h，再放入沸水中煮沸10min将酶灭活，同上述斐林试剂滴定法一样，用反应液滴定斐林试剂，滴定至蓝色消失时，记录所用溶液的体积V。所计算的公式同上。2.3试验方法2.3.1固定化酶的制备（1）酶液的制备糖化酶的最适pH在4.0-4.5之间[18]，故采用pH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置不同浓度的酶溶液。（2）固定化酶的制备分别制取1%，2%，3%，4%的海藻酸钠溶液，制作时发现随着浓度的增大，粘稠度越大,4%时过稠，用注射器滴小球时，形成的小球不是特别规则。由张浩等人的微胶囊法固定化糖化酶的研究[19]可知,当海藻酸钠浓度为2%时，制得固定化酶活力最高。这是因为海藻酸钠浓度过低时，所形成的海藻酸钙凝珠不够致密，糖化酶不能很好地包埋在里面，其包埋率较低，随着海藻酸钠浓度的增加，海藻酸钙凝珠的机械强度增加，表面更加致密，其中的糖化酶很少泄漏，反应时底物扩散到小球内部也比较困难。借鉴顾旭炯[20]等人制备固定化酶的方法，称取1g海藻酸钠加入到50mL的水中，放入到65℃的水浴中搅拌溶解，加入5mL一定浓度pH为4.6的酶溶液,待充分搅拌均匀后，用25mL的注射器[21]吸取10mL距离氯化钙溶液液面约10cm处滴入至一定浓度的CaCl2溶液中，形成直径为3-4mm的海藻酸钙凝胶珠[22]，制备过程中还要严格控制滴加的速度[23]，掌握滴加的力度，使溶液均匀滴出，每一份的制备必须在5min内完成。制备完成之后，于4℃冰箱中静置一段时间，取出后滤干并用蒸馏水冲洗数次。在使用之前，将制得的固定化酶放在40℃的干燥箱中干燥10min至表面的水分蒸干，测定其酶活力。2.3.2海藻酸钙包埋法固定化葡萄糖淀粉酶的研究按下表2-4进行固定化酶条件的优化表2-4海藻酸钙包埋法固定化葡萄糖淀粉酶的实验方案12345678给酶量（mg）51015202530--CaCl2浓度（%m/v）0.51.01.52.02.53.03.54.0形成时间（h）0.512345-—（1）给酶量的确定用pH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml的酶液。取6份2%的海藻酸钠溶液，分别加入5mL上述浓度的酶液，65℃下混合均匀后，滴入到2%的CaCl2溶液中，于4℃下静置2h。清洗干燥10min后测定酶活力。（2）CaCl2浓度的确定配置八份50mL浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0%（m/v）的氯化钙溶液。称取一份150mL浓度为2%的海藻酸钠溶液，加入15mL10mg/ml酶溶液，65℃下混合均匀后，分别滴入10mL于不同浓度的氯化钙溶液中，于4℃下静置2h。清洗干燥10min后，分别测定酶活力。（3）形成时间的确定称取一份100mL浓度为2%的海藻酸钠溶液，加入10mL10mg/ml酶溶液，65℃下混合均匀后，滴入到2%的CaCl2溶液中，于4℃下分别静置0.5、1、2、3、4、5h后取出，清洗干燥10min后，分别测定酶活力。2.3.3正交试验在单因素试验的基础上选取各因素的最适条件，对海藻酸钙包埋法固定化葡萄糖淀粉酶做正交试验[24]，确定此法固定酶的最佳工艺，并对最佳组合进行试验来验证。2.4结果与讨论2.4.1固定化酶图2-1制备的固定化酶如上图所示，制备出来的固定化酶凝珠直径约为3-4mm，表面比较光滑，只是有少部分酶带有小小的尾部，球形不是很规则，刚刚滴进氯化钙溶液的凝珠呈透明状，形成一定时间抽滤出来后，呈白色半透明状，当所含的酶越多时，可以看出凝珠带有酶的浅棕色，形成的凝珠有一定的弹性，也有一定的硬度。2.4.2给酶量的确定表2-5不将上述六份含有不同酶量的海藻酸钙凝珠置于六份50mL浓度为2%的淀粉溶液中，并加入10mLpH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，65℃下反应1h后，立即取出后放入沸水中煮沸10min，摇匀后用移液管取出所有液体，装入50mL的酸式滴定管中，另取取斐林溶液A、B各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加10mL水稀释，加热使其于5min内沸腾，在沸腾状态下用滴定管滴入上述溶液至蓝色即将消失时，加入1～2滴次甲基蓝指示液，继续滴定至瓶内蓝色消失，记录所用反应溶液的体积，并计算酶活力。当滴定体积在15mL以下时，将反应液稀释2倍，滴定体积记为V2。同给酶量对固定化糖化酶酶活力的影响123456给酶量（mg）51015202530滴定体积（ml）36.2316.30V2(ml)--26.1521.0321.8121.58酶活力（U）90.12200.32249.73310.53299.42302.61如图2-2所示，随着给酶量的增大，酶活力逐渐增大，当给酶量由5mg增加到10mg时，酶活力增加了约2.2倍；当给酶量由10mg增加到20mg时，酶活力的增加幅度明显减小，仅增加了1.55倍；但是当给酶量达到20mg时，酶活力变化幅度几乎不变。这是由于每个海藻酸钙凝珠的体积是一定的，其中所含的酶结合位点也是一定的，当给酶量达到近20mg时，载体的结合位点几乎已经被糖化酶饱和，尽管继续增加给酶量，所能被包埋的酶量已经达到饱和状态，所以固定化酶活力不会持续增大。2.4.3CaCl2浓度的确定酶活力的测定方法同上，数据如表2-6所示。表2-6不同CaCl2浓度对固定化糖化酶酶活力的影响12345678CaCl2浓度（%m/v）0.51.01.52.02.53.03.54.0滴定体积（ml）16.5215.9112.3011.5011.9212.3414.0014.95V2(ml)33.2432.0225.0423.4124.0525.6027.6326.82酶活力（U）196.46203.95260.80278.96271.53255.09236.35243.49通过观察制备出来的八组海藻酸钙凝珠发现，当氯化钙浓度为0.5%时，滴出的小球不能立即成形，在4℃下形成2h后，可以看出第一组的凝珠的体积明显比后面几组的大，硬度也不及后面的凝珠，经过1h的反应过后，凝珠的体积又胀大一点，而且有些凝珠已经破碎。故反应中酶从破碎的凝珠中泄露出来，使结果中比1%固定的酶的活力大一些。但是工业生产中存在机械搅拌，酶也不利于回收利用。由图2-3可以看出，随着氯化钙浓度的增加，固定化酶活力逐渐增加；当氯化钙浓度为2%时，制得的固定化酶活力最高；当氯化钙浓度继续增加时，固定化酶活力反而下降。由文献[19]可知，当使用的氯化钙浓度过高时，氯化钙溶液中的钙离子通过三个水分子达到与糖化酶络合的目的，使固定化酶与底物作用的活性部位被封闭，从而是固定化酶的活力降低了；另一方面，太高的氯化钙浓度，会使得形成的凝珠较硬，海藻酸钙网孔过小[25]，阻碍了底物与酶的反应。而氯化钙浓度过低时，形成的网孔比较大，每次用蒸馏水冲洗后，流失了一定的酶，导致酶活力较低。2.4.4形成时间的确定表2-7不同形成时间对固定化糖化酶酶活力的影响123456形成时间（h）0.512345滴定体积（ml）12.2525.8422.5021.2124.6825.25V2(ml)25.03酶活力（U）260.90126.36145.12153.95132.30129.31由图2-4可知，当形成时间为0.5h时，酶活力最大，为260.90U；当形成时间从1h变到5h时，酶活力呈现先增加后减小的趋势，在形成时间为3h时达到最大酶活力，为153.95U。形成时间很短的时候，酶活力最大，可能由于海藻酸钠和氯化钙中的钙离子反应生成致密的海藻酸钙凝胶，将酶包埋在内，是一个过程，需要一定的时间来完成，如果时间过短，酶没有很好地包埋，所形成的网状结构的孔隙也比较大，在反应的过程中，酶容易从载体中泄漏出来；但是如果时间过长，形成的网状结构会更致密，使得底物进入海藻酸钙凝珠内与糖化酶反应受到阻碍，所以体现出酶活力的下降。所以综上，形成时间为3h时最适宜。2.4.5正交试验选取三个因素：给酶量、氯化钙浓度、形成时间进行优化并探讨其显著性。设计的正交试验参考刘思聪[26]的研究。根据单因素实验结果做正交试验，海藻酸钙包埋法固定葡萄糖淀粉酶的因素水平表见表2-8。表2-8海藻酸钠包埋法固定葡萄糖淀粉酶的因素水平表水平因素给酶量（mg）CaCl2浓度（%m/v）形成时间（h）1181.52.52202.033222.53.5表2-9海藻酸钙固定化葡萄糖淀粉酶的正交试验结果实验号ACaCl2浓度（%）B形成时间（h）C给酶量（mg）滴定体积（ml）酶活力（U）11（1.5%）1(2.5)1(18)21.48152.01212(3)3(22)14.72（29.41）217.53313(3.5)2(20)14.83（29.50）221.3742（2%）1313.00（26.45）246.86522213.91（27.73）235.50623114.70（29.34）222.5773(2.5%)1217.51186.48832118.21179.31933314.59（29.25）223.26K1590.91585.35553.89K2704.93632.34643.35K3589.05667.20687.65k1196.97195.12184.63k2234.98210.78214.45k3196.35222.40229.22R38.6327.2844.59其中K代表各水平实验结果总和，k代表各水平实验结果平均值，R为极差，也就是这一列中最好与最坏结果的差值。由表2-9可知，A2B3C3为最优组合，即氯化钙浓度为2%，形成时间为3.5h，给酶量为22mg的固定化条件下，固定化酶活力达到最高。由极差可以看出，固定化酶制备的以上三个因素中，给酶量对固定化酶的酶活力影响最为显著，其次为氯化钙的浓度，最不明显的是形成时间。在正交表中没有A2B3C3，因此在氯化钙浓度为2%，形成时间为3.5h，给酶量为22mg的固定化条件下验证试验，得到A2B3C3组合固定化酶活力达到267.32U，单位质量的酶活力为12151U/g。2.5小结控制给酶量为变量时，取氯化钙浓度为2%，形成时间为2h，当给酶量为20mg时，酶活力达到最大，为310.53U。控制氯化钙浓度为变量时，取给酶量为10mg，形成时间为2h，当氯化钙浓度为2%时，酶活力达到最大，为278.96U。控制形成时间为变量时，取给酶量为10mg，氯化钙浓度为2%，当形成时间为3h时，酶活力达到最大，为153.95U。（4）通过三因素三水平正交试验得出，氯化钙浓度为2%，形成时间为3.5h，给酶量为22mg是最佳组合，固定化酶活力达到267.32U，单位质量的酶活力为12151U/g。3海藻酸钙固定化葡萄糖淀粉酶特性的研究固定化酶相比于游离酶，它的结构发生了转变，因为当酶被包埋在一个稳定的环境中后，固定化酶对于外界的环境的承受力远远大于游离酶，特别是针对这些3-4mm的凝珠，在反应过后也利于回收，用于重复使用，相比于游离酶来说，是一个很大的优势。本章着重对动力学常数，重复使用稳定性做了研究。3.1材料和方法3.1.1实验材料和试剂表3-1实验试剂与材料药品名纯度生产厂家可溶性淀粉分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司碘（粒状）分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司碘化钾分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司盐酸分析纯成都市科龙化工试剂厂重蒸酚分析纯成都市科龙化工试剂厂3,5-二硝基水杨酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司亚硫酸钠分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司3.1.2仪器与设备紫外可见分光光度计（UV752，上海凤凰光学科仪有限公司）3.2测定方法3.2.1酶活力的测定将一定量固定化酶与淀粉溶液在最适条件下（pH为4.6,温度为65℃）反应一定的时间，然后取上述反应液用DNS法测定还原糖含量，得出各管的吸光度，再由葡萄糖标准曲线的方程式得出所生成的葡萄糖的含量，最后换算成酶活力。将葡萄糖淀粉酶反应的最适温度和pH下，每小时生成1mg葡萄糖所需的酶量定为一个活力单位，即1IU=1mg/h。3.2.2葡萄糖标准曲线的制备按表3-2量取试剂，测定各管的吸光度，绘制标准曲线。表3-2标准葡萄糖曲线浓度的量取管号葡萄糖液/ml蒸馏水/mlDNS试剂/ml蒸馏水/ml葡萄糖浓度/（mg/ml）A540101.0180020.10.9180.10.08930.20.8180.20.23840.30.7180.30.37550.40.6180.40.49160.50.5180.50.64370.60.4180.60.71780.70.3180.70.86490.80.2180.81.0073.3试验方法3.3.1葡萄糖淀粉酶米氏常数的测定（1）游离酶米氏常数的测定取不同浓度的可溶性淀粉进行比色反应，具体操作见表3-3表3-3淀粉浓度梯度吸光度1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51缓冲液（ml）0.750.750.750.750.750.75蒸馏水（ml）5充分摇匀，60℃放置10min加入3.0ml的0.2mol/LHCl，摇匀取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液显色，再取1ml稀释10倍，以稀碘液为对照A6600.2180.3460.4380.5120.6110.685配置1mg/ml的葡萄糖淀粉酶。按照表3-4测定游离酶的Km。表3-4游离酶的Km测定1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51缓冲液（ml）0.750.750.750.750.750.7560℃放置，预热5min酶液（ml）5充分摇匀，60℃放置10min加入3.0ml的0.2mol/LHCl，摇匀取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液显色，再取1ml稀释10倍，以稀碘液为对照A6600.0230.1090.1790.2660.3650.413可溶性淀粉浓度（%）0.51.01.52.02.53.01/[S]20010066.67504033.33V0.1950.2370.2590.2460.2460.2721/V64.073.763.68固定化酶米氏常数的测定试剂的加入如表3-3，只是在将取好的六组淀粉溶液放在60℃的热水中预热5min后，向各试管中加入1g的固定化酶，结果如表3-5所示。表3-5固定化酶的Km测定123456A6600.0840.1780.2530.3120.4100.480可溶性淀粉浓度（%）0.51.01.52.02.53.01/[S]20010066.67504033.33V0.1340.1680.1850.2000.2010.2051/V7.465.955.405.014.984.88根据参加反应的底物浓度和酶的反应速度作出Lineweaver-Burk双倒数曲线[27],如图3-2可知。由作图得出的回归方程求出游离酶的Km为2.50mg/ml，固定化酶的Km为3.63mg/ml，显然，固定化酶的Km比游离酶的大一些，也就是说明酶经过固定化以后，它与底物的亲和力降低了，造成这一结果的主要原因是酶被固定在载体内，底物和酶接触存在一定的空间阻碍，底物和酶的扩散都受到了一定的限制。相比于陈雄等人利用交联法制备的固定化酶[28]，包埋法的亲和力更大。3.3.2重复使用稳定性的测定（1）固定化酶的制备吸取2ml的海藻酸钠和酶液的混合液滴到氯化钙溶液中，其他步骤同上。（2）DNS法测还原糖[29]取10支试管，各加入10ml的2%的淀粉溶液和2ml的pH为4.6的缓冲液，先将第一支试管放入65℃的水中预热5min，然后加入制备好的固定化酶，准确反应10min后，摇匀，取出1ml的反应液，然后过滤反应液，回收固定化酶，并用蒸馏水清洗数次，再将第二支试管放入水浴锅中重复上述步骤，直到第十支试管。将取出的1ml的反应液中各加入1ml的DNS，沸水浴10min，取出后再各加入8ml的蒸馏水，最后在540nm下测吸光度。结果如表3-6所示。表3-6重复使用后还原糖的测定12345678910OD5401.4881.4331.2371.3241.3691.2521.2041.0830.8450.734G/mg14.2713.7411.8812.7113.1412.0211.5710.428.167.10随着使用次数的增加，生成的葡萄糖的量逐渐减少，也就相当于酶活力逐渐降低。在使用第三次时，酶活力下降幅度较大，可能是由于经过了两次清洗，是结合不够牢固的酶脱落了；而第四次和第五次又有稍微上升的趋势，可能是由于长时间泡在溶液中，将凝胶表面的孔隙变得比之前大一些[30]，使底物和产物更易进出，直到使用的次数的增加，酶经过反应、清洗等过程不断的泄漏，活性也就不断下降；使用10次之后，酶活性还有原来的50%。观察反应后酶的变化可知，当使用次数达到五次时，酶的体积稍微有点增大，到使用第六次的时候，部分固定化凝珠出现了从中间溶胀裂开的现象。但是相对于游离酶来说，固定化酶具有一定的体积，便于我们回收利用，酶本身价格昂贵，固定化酶的使用也可以为工业生产会减轻一定的成本。3.4小结（1）海藻酸钙固定化糖化酶的米氏常数与游离酶的相差不是很大，游离酶的Km为2.50mg/ml，固定化酶的Km为3.63mg/ml，也就是通过固定化之后，酶对底物的亲和力降低了。（2）随着使用次数的增加，酶活性逐渐降低，但是每次反应10min，在使用10次之后，酶活性还有原来的50%。4结论与展望4.1结论本次研究采用的是海藻酸钠为载体，利用包埋法固定葡萄糖淀粉酶。筛选出了固定化酶的制备时的最适给酶量、氯化钙浓度、形成时间，在此基础上，也进一步研究了固定化酶的米氏常数和重复使用稳定性。（1）在单因素实验基础上，通过三因素三水平正交试验得出，氯化钙浓度为2%，形成时间为3.5h，给酶量为22mg是最佳组合，固定化酶活力达到267.32U，单位质量的酶活力为12151U/g。（2）游离酶的Km为2.50mg/ml，固定化酶的Km为3.63mg/ml，通过固定化之后，酶对底物的亲和力降低了。（3）随着使用次数的增加，酶活性逐渐降低，但是每次反应10min，在使用10次之后，酶活性还有原来的50%。4.2展望国内外研究的葡萄糖淀粉酶的固定化技术很多，但是还是存在一些问题有待解决。固定化酶的酶活力相对于游离酶来说还不是很高，需要对载体、固定化方法、制备条件做出进一步的研究。实验室中制备固定化酶时是采用的人工用注射器滴加，在工业生产中还需研制一种利于工业自动化制备固定化酶的机器。试验中还发现，反应过的固定化酶若不进行及时处理，长时间浸泡在反应液中，部分固定化酶会溶解；若将刚制备的固定化酶长时间暴露在空气中，固定化酶也会慢慢失水变干，萎缩成粒状。所以要加强对生产的固定化酶的保存的研究，使固定化酶更适合于工业生产中。致谢衷心感谢我的指导老师刘颋老师。本论文从选题到完成，都离不开刘老师的悉心指导。在此，谨向刘老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！在开题之初，刘老师给我详细地讲解了本论文的研究内容和方向，还为我们查找了大量的文献，要求我大量阅读，并且理出本次试验的思路，书面写出所用的材料和仪器、步骤，并大致估计预期试验结果；实验过程中，刘老师也给予了我很大的帮助，实验开始进行并不是那么顺利，总会出现一些我自己无法解决的问题，知识上本身也有一定的欠缺，思考问题也不是很周全，但是每一次出现的问题，刘老师都能耐心指导，热心和我们探讨，找出解决方法，在这个过程中，刘老师还培养了我自己的动手能力和及时做实验结论的好习惯；在论文写作方面，刘老师为我的论文写作做出了详尽的修改。感谢杨裕启老师为我实验过程中提供的药品和杨老师的无私指导。同时，也非常感谢朱晓峰同学、张开同学在实验过程中的无私帮助和支持。最后感谢所有关心和帮助我的老师、同学、亲人。参考文献[1]郭伟利,侯红萍.磁性壳聚糖微球固定化糖化酶的研究[J].酿酒科技.2010,(3):17-19.[2]顾旭炯.双酶体系的共固定化及其动力学研究[D].浙江:浙江工业大学,2006.[3]李柱来,陈盛,康杰.α-淀粉酶在壳聚糖上的固定化研究[J].福建医学院学报,1994,28(3):273-276.[4]吴颉.磁性高分子微球固定化α-淀粉酶的研究[D].黑龙江:哈尔滨工程大学,2003.[5]蒋珺.丙烯晴/丙烯酸共聚物纳米纤维膜的制备及脂肪酶的固定化[D].浙江:浙江大学,2007.[6]王卫,李忠海,黎继烈等.海藻酸钙固定赤霉菌菌丝产素的研究[J].中国生物工程杂志,2012,32(1):36-41.[7]梁力曼.PS-TEPA、PS-g-PEG600树脂合成及其固载α-淀粉酶研究[D].无锡：江南大学,2008.[8]易柳香.新型反应性载体的设计与制备及其固定化猪胰脂肪酶的研究[D].甘肃:兰州大学,2007.[9]OmPrakash,NiveditaJaiswal.ImmobilizationofaThermostable"-AmylaseonAgaroseandAgarMatricesanditsApplicationinStarchStainRemoval[J].WorldAppliedSciencesJournal.2011,13(3):572-577.[10]赵炳超.介孔分子筛固定化酶的研究[D].北京:北京化工大学,2005.[11]叶鹏.丙烯晴/马来酸共聚物膜与脂肪酶的固定化[D].浙江:浙江大学,2006.[12]侯红萍,王家东.壳聚糖一海藻酸钠共混凝胶制备及其包埋固定糖化酶的研究[J].中国食品学报,2009,9(3):50-57.[13]侯红萍,张茜.介孔分子筛SBA-15固定糖化酶的研究[J].中国食品学报，2011,11(2):147-151.[14]董昭,周志明.海藻酸铝固定化糖化酶特性研究[J].应用化工,2010,39(6):886-888.[15]郭海学.纤维素载体固定化糖化酶的研究[J].扬州教育学院报,2001,19(3):11-13.[16]郭桥,罗贵民,孙起安等.α-淀粉酶与糖化酶的共固定化研究[J].生物化学杂志，1994,10(3):259-263.[17]天津轻工业学院，大连轻工业学院，无锡轻工业学院,工业发酵分析[M].北京：轻工业出版社,1980,18-20.[18]顾旭炯,刘璘,楼坚等.硅藻土共固定化淀粉酶和糖化酶的研究[J].饲料工业，2006,27(18):24-28.[19]张浩,郭剑霞,侯红萍.微胶囊法固定化糖化酶的研究[J].山西农业大学学报，2000,29(3):265-269.[20]顾旭炯,朱巍,刘志强等.海藻酸钠包埋法共固定α-淀粉酶和糖化酶的研究[J].化学与生物工程,2006,23(5):26-28.[21]赵林果,李丽娟,王平等.海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究[J].生物加工过程,2007,5(4):25-31.[22]SachinTalekar,SandeepChavare.Optimizationofimmobilizationofα-amylaseinalginategelanditscomparativebiochemicalstudieswithfreeα-amylase[J].RecentResearchinScienceandTechnology,2012,4(2):01-05.[23]徐娟.耐热性酶的固定化初步研究[D].江苏:江南大学,2008.[24]刘志国.生物化学实验[M].湖北:华中科技大学出版社.2007,134-137.[25]黄铃.琼脂包埋法固定α-淀粉酶特性的研究[J].化学与生物工程.2007,24(8):56-58.[26]刘思聪.β-D-半乳糖苷酶壳聚糖固定方法、特性及应用研究[D].陕西:西北农林科技大学,2006.[27]王镜岩,朱圣庚.生物化学[M].第三版,北京:高等教育出版社.2002,334-337.[28]张光一,刘增然.糖化酶固定化研究现状[J].河北经贸大学报.2006,6(4):102-104.[29]董晓燕.生物化学实验[M].第二版,北京:化学工业出版社.2008,54-56.[30]王家东,姜子明等.固定化糖化酶的研究[J].中国调味品.2006,(3):14-16.基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究基于单片机的嵌入式Web服务器的研究MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器单片机控制的二级倒立摆系统的研究基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现基于单片机的蓄电池自动监测系统基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制基于单片机的自动找平控制系统研究基于C8051F040单片机的嵌入式系统开发基于单片机的液压动力系统状态监测仪开发模糊Smith智能控制方法的研究及其单片机实现一种基于单片机的轴快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于双单片机冲床数控系统的研究基于CYGNAL单片机的在线间歇式浊度仪的研制基于单片机的喷油泵试验台控制器的研制基于单片机的软起动器的研究和设计基于单片机控制的高速快走丝电火花线切割机床短循环走丝方式研究基于单片机的机电产品控制系统开发基于PIC单片机的智能手机充电器基于单片机的实时内核设计及其应用研究基于单片机的远程抄表系统的设计与研究基于单片机的烟气二氧化硫浓度检测仪的研制基于微型光谱仪的单片机系统单片机系统软件构件开发的技术研究基于单片机的液体点滴速度自动检测仪的研制基于单片机系统的多功能温度测量仪的研制基于PIC单片机的电能采集终端的设计和应用基于单片机的光纤光栅解调仪的研制气压式线性摩擦焊机单片机控制系统的研制基于单片机的数字磁通门传感器基于单片机的旋转变压器-数字转换器的研究基于单片机的光纤Bragg光栅解调系统的研究单片机控制的便携式多功能乳腺治疗仪的研制基于C8051F020单片机的多生理信号检测仪基于单片机的电机运动控制系统设计Pico专用单片机核的可测性设计研究基于MCS-51单片机的热量计基于双单片机的智能遥测微型气象站MCS-51单片机构建机器人的实践研究基于单片机的轮轨力检测基于单片机的GPS定位仪的研究与实现基于单片机的电液伺服控制系统用于单片机系统的MMC卡文件系统研制基于单片机的时控和计数系统性能优化的研究基于单片机和CPLD的粗光栅位移测量系统研究单片机控制的后备式方波UPS提升高职学生单片机应用能力的探究基于单片机控制的自动低频减载装置研究基于单片机控制的水下焊接电源的研究基于单片机的多通道数据采集系统基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制基于单片机的红外测油仪的研究96系列单片机仿真器研究与设计基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现基于MSP430单片机的电梯门机控制器的研制基于单片机的气体测漏仪的研究基于三菱M16C/6N系列单片机的CAN/USB协议转换器基于单片机和DSP的变压器油色谱在线监测技术研究基于单片机的膛壁温度报警系统设计基于AVR单片机的低压无功补偿控制器的设计基于单片机船舶电力推进电机监测系统基于单片机网络的振动信号的采集系统基于单片机的大容量数据存储技术的应用研究基于单片机的叠图机研究与教学方法实践基于单片机嵌入式Web服务器技术的研究及实现基于AT89S52单片机的通用数据采集系统基于单片机的多道脉冲幅度分析仪研究机器人旋转电弧传感角焊缝跟踪单片机控制系统基于单片机的控制系统在PLC虚拟教学实验中的应用研究基于单片机系统的网络通信研究与应用基于PIC16F877单片机的莫尔斯码自动译码系统设计与研究基于单片机的模糊控制器在工业电阻炉上的应用研究基于双单片机冲床数控系统的研究与开发基于Cygnal单片机的μC/OS-Ⅱ的研究基于单片机的一体化智能差示扫描量热仪系统研究基于TCP/IP协议的单片机与Internet互联的研究与实现变频调速