荧光素酶报告实验(共3篇)

1/1荧光素酶报告实验(共3篇)荧光素酶报告实验第1篇转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的调控作用。荧光素酶报告基因实验就是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

荧光素酶（Luciferase）：是能够催化底物氧化发光的一类酶的统称。

荧光素酶的种类很多，其中应用较为广泛的是萤火虫荧光素酶（Fireflyluciferase，FLUC）和海肾荧光素酶（Renillaluciferase，RLUC）

在ATP、Mg2+、O2存在的条件下，虫荧光素在虫荧光素酶的催化下氧化发光，发光颜色为黄绿色。

Luciferase报告基因系统是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin被氧化成oxyluciferin的反应，在luciferin被氧化的过程中会发出生物荧光，然后可以通过仪器测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。

例如，我们想要研究某个转录因子是否能与某一靶启动子片段有作用。

（1）在质粒中，将靶启动子（或其他要研究的基因调控元件）插入到荧光素酶报告基因前方，构建成报告基因质粒。

（2）将可以表达要检测的转录因子的质粒与报告基因质粒共转染细胞，如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等)对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因(Rinillaluciferase的质粒(pRL-TK)作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂Ⅱ(LARII)时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo?试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量

荧光素酶报告基因的优点

◆蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。

◆在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。

◆高效，检测快速，每个样品只需几秒钟。

荧光素酶报告实验第2篇荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（FireflyLuciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinuspyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（RenillaLuciferase）则是从海肾（Renillareniformis）中分离，分子量为36kDa。

荧光素酶报告实验第3篇·Day1种细胞于24孔板

·Day2病毒感染（根据实验加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE）

·Day3Report质粒转染（以24孔板一个孔为例，实验时可配置成Mix逐孔加入以减少误差）:

25ulopti-MEM+300ngplasmid+10ngpRL-CMV

25ulopti-MEM+lip20XX

6h后换液

（实验分组可参考下图，每个组可以设置3个重复孔）

·Day4双报告基因检测

（1）1XcoldPBS清洗一遍，加入80-100ullysisbuffer（buffer用量可以根据细胞量进行调整）；

（2）在摇床上冰上被动裂解30min；

（3）4℃，120XXrpm离心10min；

（4）吸取上清10ul于luciferase专用96孔板；

（5）依次加入50ulFir