版中国药典卫生学检验培训 版《中国药典》微生物检验技术（崔学文）

2021年版?中国药典?微生物

检验技术崔学文四川省食品药品检验所2021年3月主要内容一、药品微生物检验现状二、中国药典2021年版微生物检验增修订内容简介三、微生物检查方法验证试验(一)药品微生物检验现状药品质量标准【性状】【鉴别】【检查】无菌/微生物限度【含量测定】药品微生物检验概况药品质量体系平安性有效性

药品质量体系构成与相互关系可控性药品中污染的微生物通过微生物体及其分泌代谢产物导致机体过敏、中毒、感染等，严重的可以直接导致菌血症危及生命。此外，某些药品中污染微生物通过代谢活动改变药物组成、破坏有效成份而造成疗效改变或丧失。药品微生物检验概况所以，世界各国高度重视药品微生物检查，无菌/微生物限度检查均为各国药典中的重要内容。药品微生物检验概况我国的微生物检验无菌检查——始于1953年新中国第一部药典〔版〕微生物限度检查——始于1972年由来：1972年日商在进口我国的中成药中发现污染了大量细菌，同时还检出大肠杆菌，向我方提出交涉，引起我国政府的高度重视，于是我国开始了微生物限度检查工作，接着三部组织联合调查京津沪的中药厂，国务院为此发了[73]121号文件，要求加强管理提高中成药的质量药品微生物检验概况在中央和各地政府有关部门的关心和重视下，经过我国药品微生物检验工作者几十年来的艰苦奋斗，我国药品微生物检验工作不断开展，标准不断完善，逐步建立起了符合我国国情的药品微生物检验标准体系。至2021版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。药品微生物检验概况近3年来发生的药害事件时间事件结果2006年5月“齐二药”亮菌甲素及其全线产品调查170批产品无菌检查合格，证明与微生物污染无关2006年7月“欣弗事件”微生物污染2007年1月“克林霉素磷酸酯”及“阿奇霉素”扩大调查克林107批7批无菌不合格；阿奇90批3批无菌不格。取缔两个品种的热力灭菌大体积液体制剂生产。2007年4月注射用甲氨喋呤及时排除微生物污染2008年10月“刺五加事件”及全线产品调查微生物污染2008年11月“茵栀黄事件”与微生物污染无关?2009年“双黄连注射液”有无微生物污染？技术落后、标准化程度低；重要性被无视、事故频繁！——标准进步与标准化滞后的矛盾药品微生物检验现状无菌检查现状1、方法的修订与完善2、技术现状与标准化3、无菌检查的几个问题

1、方法的修订与完善2005年版无菌检查法主要方面与USP、BP的比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定人员要求无具体规定正确培训和认可细菌检查培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基真菌检查培养基改良马丁培养基大豆－胰酪胨培养基大豆－胰酪胨培养基培养基灵敏度检查与方法验证用菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、黑曲霉检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法性状允许的样品均可采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除稀释剂与薄膜过滤冲洗液0.1％蛋白胨水溶液；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液供试品处理中的其他内容A、D、K0.1％蛋白胨水溶液（0.1％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐温-80）；十四烷酸异丙酯培养条件与时间14天（+2；3天）不少于14天（+不少于4天）14天（＋7天）结果判断与复试规定一次结果为准(设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)硫乙醇酸盐流体培养基

FluidThioglycollateMedium药典USP29EP-2001中国药典-2005名称FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸盐流体培养基FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸盐流体培养基FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸盐流体培养基目的培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧微生物培养条件14天于30-35°C配方PancreaticDigestofCasein(胰酪蛋白胨)....................15.0gYeastExtract(酵母浸出粉)..................................5.0gDextrose(葡萄糖)............................................5.5gSodiumChloride(氯化钠).....................................2.5gL-Cystine(L-胱氨酸).......................................0.5gSodiumThioglycollate(硫乙醇酸钠)..........................0.5gAgar(琼脂).................................................0.75gResazurin(刃天青).........................................1.0mg2005年版无菌检查培养基与USP、BP的比较1大豆胰酪胨培养基(TSB)

改进马丁培养基药典USP29EP-2001中国药典2005版名称TrypticSoyBroth(Soybeancaseindigestmedium)大豆－胰酪胨培养基改良马丁培养基配方PancreaticdigestofCasein(胰酪蛋白胨)……………..7.0gPapaicDigestofSoybeanMeal………….3.0gSoldiumChloride……………..……………5.0gDibasicPotassiumPhosphate…………...2.5gDextrosemonohydrate……..…………..…2.5g蛋白胨……..5.0g酵母浸出粉…………..…2.0g葡萄糖………………....20.0g磷酸氢二钾……………..1.0g硫酸镁(MgSO4.7H2O)….0.5g目的支持广泛微生物的生长,包括需氧菌、兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）用于培养真菌培养条件14天于30-35°C及20-25°C14天于20-25°C2005年版无菌检查培养基与USP、BP的比较2中国药典无菌检查培养基差异造成的问题与对策问题：实验条件对号入座漏检结果判断对号入座漏检对策：强调两个培养基条件的互补性，实验上同等对待，结果判断上不要受误导，避免漏检。

3、无菌检查的几个问题1〕、无菌检查的认识误区——如何正确认识无菌检查？2〕、抗菌药物的无菌检查——如何去除抗菌活性？3〕、外用制剂及眼用制剂的无菌检查——如何去除基质影响？1〕、无菌检查的认识误区“欣弗事件〞反映了我国一些企业在微生物控制方面存在的严重问题；而更为严重的是一些企业普遍存在的无菌检查认识误区。

——为什么要做无菌检查？1、有最后灭菌保证，中间不需要控制？2、我们现在生产条件很好，GMP，不用再强调终产品的检查？——为什么抗生素产品也要做无菌检查？1、抗生素抗菌谱的限制；2、污染微生物的亚致死、休眠状态。1、药典要求。2、抗生素产品的无菌检查——欣弗的情况如此，那么有“天然抗生素〞美誉的鱼腥草等中药注射剂情况又该如何？3、近年来频繁出现的中药注射剂不良反响问题有没有污染微生物的可能？——为什么中药注射用产品无菌检查也要采用薄膜过滤法？2〕、抗菌药物的无菌检查抗菌类药物由于对微生物生长的抑制作用，怎样合理检验，一直争论较多。这其中关键的困惑来自于关于药品中受损、受抑制或处于静息状态微生物的根底研究的缺乏。肯定的一点是，应尽量去除药物对微生物生长的影响。USP29每膜最多冲洗500ml；BP2002和JP14每膜冲洗不大于1000ml；中国药典2005年版以所有阳性对照菌生长为目标。去除抗生素抗菌的活性，使得处于亚致死、休眠状态的污染微生物复苏、生长而得以检出。2〕、抗菌药物的无菌检查主要解决措施：喹诺酮类——以MnSO4溶液为中和剂；参见：?加替沙星无菌检查方法的建立与标准操作探讨?，马仕洪、刘鹏、戴翚，?药物分析杂志?，2007，27〔6〕：877～880β-内酰胺类——以β-内酰胺酶为中和剂；参见：?简化注射用头孢菌素无菌检查法的探讨?，戴翚、刘鹏、马仕洪，?药物分析杂志?，2007，27〔2〕：208～211氨糖类及其他抗生素——改善冲洗条件。

每膜冲洗500ml以内根本都能解决问题。R1R2R3HH环丙沙星CH2CH3CH3F洛美沙星CH2CH3HH诺氟沙星CH3OCH3加替沙星CH3CHF3卡德沙星多价金属阳离子对喹诺酮类的络合作用五种喹诺酮类抗生素的结构，并且由3、4位上的羰基与镁、猛等金属离子配位生成稳定的六元环络合物，药物与金属离子的络合比为2：1头孢类抗生素无菌检查样品名冲洗量（ml）大肠铜绿生孢金葡枯草白念黑曲霉头孢拉定50030030050040000头孢呋辛钠50030030050040000头孢替安40030030050030000头孢曲松钠50030030040040000头孢哌酮钠40040030040030000头孢哌酮钠舒巴坦钠50040030040040000头孢匹罗500//500///几种头孢菌数无菌检查冲洗量通过400ml稀释液的溶解，滤过，采用0.1%蛋白胨溶液冲洗〔表7〕，阳性对照菌均可正常生长。从方法学研究到常规分析...常规分析SOP验证未生长生长假阴性的结果?阴性的结果？阳性的结果?假阳性的结果？方法学研究完全按照验证过的方法实施/SOP调查原因

环境

无菌性:培养基/缓冲液

操作规范

验证实验实验操作的标准化验证试验的系统化制定标准的严谨化完备的实验室保障系统最终目标：一次检验即可得到准确结果。微生物限度检查现状1、方法和标准的修订与完善2、技术现状与标准化3、微生物限度检查的几个问题1、方法和标准的修订与完善中国药典2005版微生物限度检查法与英美药典比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定计数测定方法平皿法、薄膜过滤法、MPN平皿法、MPN平皿法、薄膜过滤法、MPN控制大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金葡球菌、大肠菌群、肠道菌、肠杆菌科大肠埃希菌、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌；肠杆菌科及某些革兰阴性菌稀释液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培养基/乳糖肉汤培养基pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；乳糖肉汤/其他培养基培养条件与时间细菌数：营养琼脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂，72hrs,5～7天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，48～72hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，5～7天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂、大豆酪蛋白消化物琼脂，5天控制菌检查结果判断与复试规定一次检出为准不符合标准规定，取大于25g的样品复试一次检出为准计数结果判断与复试规定第一次结果超过规定标准，复试两次，三次结果平均报告不符合标准规定，取大于25g的样品复试测定结果在规定的限度标准5倍以内均为合格样品10g或10ml+缓冲液至100ml总需氧菌TSA,35℃,48-72h真菌SDA(PDA),20-25℃,5-7d结果(cfu/mlorg)取1ml样品液USP、BP总需气菌/霉菌及酵母菌计数流程总需气菌、霉菌及酵母菌计数中国药典:玫瑰红钠琼脂,酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂对供试品的前处理和一些检验方法进行了完善；具有明显的中国特色，与国际差距显著。计数测定体系的差异：难以操作，检验繁琐需气菌总数=细菌数+霉菌及酵母菌？10001000100参见：?美英欧药典微生物限度标准的浅析?，苏德模、胡昌勤、马越，?中国药品标准?，2005年第3期1、方法和标准的修订与完善2、技术现状与标准化1〕培养基培养基质量标准。

固体培养基的灵敏度。玫瑰红钠琼脂培养基的专属性玫瑰红钠琼脂培养基的专属性当染菌较多时，玫瑰红钠琼脂培养基生长大量的细菌，给结果判断带来困难。玫瑰红钠琼脂培养基的专属性以中检所玫瑰红钠琼脂培养基〔批号：050428〕与营养琼脂培养基〔批号：050523〕比较，参加50～100cfu阳性菌在相同条件培养观察，见下表：

大肠铜绿金葡枯草营养琼脂培养基35℃培养48hrs75819179玫瑰红钠琼脂培养基35℃培养48hrs574700玫瑰红钠琼脂培养基25℃培养72hrs454100玫瑰红钠琼脂培养基专属性实验结果2、技术现状与标准化2〕、自动化程度低，仍然依赖大量的人工以方法验证为根底，引入更为便捷的供试品前处理技术，标准供试品前处理有条件的地方可以考虑引入自动稀释、自动接种、仪器判读结果等设备和技术3〕、75mm薄膜过滤器的研制征对我国中成药品种多、情况复杂，开发研制的75mm薄膜过滤器在目前的验证工作中发挥了重要作用。中国药品生物制品检定所3675mm滤器图1075mm滤器结构细部3775mm滤器〔上〕50mm薄膜上的大肠埃希菌菌落〔中〕75mm薄膜上的金黄色葡萄球菌菌落〔下〕75mm薄膜上的黑曲霉菌菌落3、微生物限度检查的几个问题原料药的微生物标准问题；药材原粉的界定问题；含豆豉、神曲等发酵成分的中成药制剂标准问题；纯化水微生物限度检查问题；原料药的微生物标准问题原料药是药品生产过程中引入微生物污染的重要来源之一，虽然一些药品在生产过程或终产品阶段可以采取一些灭菌措施杀灭污染微生物，但可能因为由此引入的死菌体、毒素等无法消除而危害患者，而原料药过高的微生物荷载可能直接挑战一些灭菌措施的有效性，造成灭菌失败，使药品存在更大的平安隐患。所以世界各国药典(原料品种占规定微生物限度品种数:BP和EP近90%,USP约30%)均规定应对原料药进行微生物检查，以消除或控制其对药品引入的微生物污染。(有最后灭菌保证，中间不需要控制？)在严格执行药品GMP的前提下，国外药典更为重视原料药的微生物检查，尤其是对一些非灭菌制剂，甚至仅仅对原料药有微生物限度控制要求，而对制剂没有强制要求。中国药典2005版参考了国外药典的这一开展趋势，对于化学药品的片剂、胶囊剂、颗粒剂等6个主要口服制剂在各论和制剂通那么中均未做微生物限度检查的强制要求，仅在附录中做出通用性要求，但很多企业不清楚这一变化的背景和两个必要前提，即严格的原料药微生物控制和严格的GMP管理，从而放松了对这些产品的微生物控制，可能会存在潜在风险。(我们现在生产条件很好，GMP，不用再强调终产品的检查？)原料药的微生物标准问题中国药典规定，对药品原辅料药的微生物检查参照相应用途的药品进行，即用于非灭菌制剂生产的原料药应按相应制剂的微生物限度标准进行微生物限度控制；而用于灭菌制剂的原料药一般应符合无菌要求。考虑到生产过程中污染微生物可能发生的变化，国外企业通常在生产上自觉执行比制剂要求更为严格的原料药微生物标准。原料药的微生物标准问题原料药的微生物标准问题〔1〕重视不够目前一些企业对原料药微生物控制的重要性和意义认识不够，对源头上的问题解决不好，加之GMP执行流于形式，造成了频繁的药品微生物污染事故发生。〔2〕标准依据不清楚目前中国药典绝大多数药品原辅料各论项下没有明确的微生物检查标准，而是需要根据实际用途去确定相应的控制标准。〔3〕抽样不正确原料药微生物检查的抽样除了应参照相应的抽样原那么，还应强调的一点是抽样的环境要求和无菌操作要求，不当的抽样方法不仅可以使得样本对总体没有代表意义、抽取的样本被污染，甚至可因抽样而污染原料。〔4〕方法不合理对于原料药微生物检查方法验证应与药品制剂微生物检查方法验证同等重视，否那么同样存在检验方法不合理、不科学，检验结果没有意义的问题。纯化水问题USP31/<1231>WaterforPharmaceuticalPurposeDrinkingWater:PourPlateMethodorMembraneFiltraionMethodSampleVolume-1.0mLminimunMaximunactionlevelsare500cfupermLPurifiedWater:PourPlateMethodorMembraneFiltraionMethodSampleVolume-1.0mLminimunMaximunactionlevelsare100cfupermLWaterforInjection:MembraneFiltraionMethodSampleVolume-100mLminimunMaximunactionlevelsare10cfuper100mL

PurifiedWater:POURPLATEORMEMBRANEFILTRATIONMETHOD1

SampleVolume—1.0mLminimum2

GrowthMedium—PlateCountAgar3

IncubationTime—48to72hoursminimum

IncubationTemperature—30to352

·····Nevertheless,inaverylowtonilcountscenario,amaximumsamplevolumeofaround250to300mLisusuallyconsideredareasonablebalanceofsamplecollectingandprocessingeaseandincreasedstatisticalreliability.3

AlsoknownasStandardMethodsAgar,StandardMethodsPlateCountAgar,orTGYA,thismediumcontainstryptone(pancreaticdigestofcasein),glucoseandyeastextract.纯化水问题2005版二部P3032021版二部P412纯化水〔PurifiedWater〕【检查】微生物限度取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查〔附录XIJ〕，细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。这一标准源于国外，在其需气菌培养基统一规定的情况下简单易行。但我国引入后，造成企业大量的意见。在药典现有条件下实际采用2ml实验，1ml测定细菌数、1ml测定霉菌和酵母菌数，再加合起来作为一个检验结果。主要问题还是培养基和检验体系的差异。(二)中国药典2021年版微生物检验增修订内容简介

中国药典20

10年版框架(卫)中国药典2021年版(卫)无菌检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原那么药品微生物检验替代方法验证指导原那么微生物限度检查法应用指导原那么药品微生物实验室标准指导原那么2021版无菌检查法修订2021年版中国药典一、二、三部的无菌检查法根本延续2005年版。2021年版中国药典三部逐渐向一、二部看齐。2021版无菌检查法修订1、附录103页，附录XIH无菌检查法第6行，增加“…防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出…〞理由：因为有些实验人员对样品的处理和火焰上的操作直接影响供试品中微生物的检出。2、附录103页，附录XIH无菌检查法第13行，增加“无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训〞理由〔1〕

无菌检查是高风险产品关乎用药平安的必检工程，为保证检验质量，必须有人员素质的保证。

而且，无菌检查是以一次检出不得复试的检验工程，实验人员必须对实验结果具有微生物学的判断能力:确定污染来源,污染菌类别或定性及是否重试等。因此无菌检查人员必须具备微生物专业知识，经过无菌技术的培训，取得相应的上岗证。否那么是不能胜任该岗位工作的.

理由〔2〕

从全国药检系统特别是药品生产企业中的用人情况来看，对从事无菌检查的岗位要求不明确，岗位上的人员也不被重视，存在着不稳定、学历偏低、素质偏低的情况。药典中增加这条规定可以保持该岗位人员的价值和稳定性。

理由〔3〕

美国药典无菌检查法中也有人员的要求。

2021版无菌检查法修订3、附录103页，培养基第5行，“…三周…〞修订为“…3周…〞第6行，“…一年…〞修订为“…1年…〞4、附录103页，培养基第7行，删除“〔用于培养好氧菌、厌氧菌〕〞倒第6行，删除“〔用于培养真菌〕〞理由：考虑所用培养基与USP/BP/EP不一致的问题，防止对号入座，减少漏检的时机，有利于提高污染菌的检出率。2021版无菌检查法修订11、附录104页，薄膜过滤法左第1行，“…将规定量…〞修订为“…取每种培养基规定接种…〞左第1行，增加“…总量…〞左倒第1行，“…按…〞修订为“…置…〞12、附录105页，直接接种法第4行，“…铜绿假单胞菌…〞修订为“…大肠埃希菌…〞第6行修订为“…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量…〞第7行，“…按…〞修订为“…置…〞理由〔1〕

根据5年来验证试验的经验，发现作为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌对大局部抗生素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。

理由〔2〕

但是，铜绿假单胞菌作为自然环境中存在的假单胞菌族的代表也有其作为试验菌的必要性，无菌检查法必须保证其能被检出。所以采取了在培养基灵敏度试验中保存铜绿假单孢菌，而在验证试验用菌和阳性对照用菌中改用大肠埃希菌。

2021版无菌检查法修订16、附录105页，阴性对照左第4行，“…如果容器…〞修订为“…如果供试品容器…〞左第5行，“…向供试品容器内导入…〞修订为“…向容器内导入…〞17、附录105页，薄膜过滤法左第4行，增加“抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜〞左第11行，“…每次冲洗量为100ml，且总冲洗量不宜过大，〞修订为“…每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不宜过大不得超过1000ml，〞理由：保证滤膜的完好性和微生物的存活。2021年版微生物限度检查法修订

2021年版?中国药典?微生物限度检查法附录XIIIC〔一部〕附录XIJ〔二部〕引入培养基适用性实验增加白色念珠菌检查法贴膏剂检查方法的改进限度标准表示方法改变2021年版微生物限度检查法修订4、附录108页，新增：贴膏剂供试品取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料〔如无菌纱布〕覆盖贴剂的粘贴面以防止贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂〔如聚山梨酯80或卵磷脂〕的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试液。理由：与国际接轨。

BP2007、EP6.0、USP30及美国、欧洲和日本三方协调一致的药品微生物限度检测方法，均对透皮贴剂规定了检测方法和限度标准。2021年版微生物限度检查法修订5、附录108页，修订：离心沉淀法取一定量供试液，500转/别离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。理由：1、离心沉淀集菌法操作的不确定性较大，试验菌回收率的分布区间较宽。2、离心集菌法的实验结果复现性差，无法准确反响供试品受微生物污染的真实程度。3、原操作规程中仅规定转数和离心时间不能很好的评价离心效果。〔近年来更多的以相对离心力〔RCF〕评价离心过程中的受力情况。其计算公式为：RCF=0.00001118×R×N2，N表示转速，R表示离心半径〕离心机Z200A3000转/分，20分钟LDZ4-1.23000转/分，20分钟RCF（g）1085.51001.7大肠埃希菌回收率61%52%金黄色葡萄球回收率10%46%实验数据：

取无菌10%葡糖糖溶液9ml置无菌离心管中〔2管〕，分别加金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌液各1ml〔500～1500cfu/ml〕，按高速离心的条件试验，离心后，用无菌吸管从离心管上部小心吸出上清液〔勿扰动底部溶液〕，留底部集菌液约2ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液补充至原量，混匀，取此供试液1ml注入平皿中，按平皿计数法测定，计算回收率。

实验数据：取无菌生理盐水溶液9ml置无菌离心管中〔2管〕，分别加白色念珠菌和枯草芽孢杆菌菌液各1ml〔500~1500cfu/ml〕，混匀，按低速离心的条件试验，在离心管上部取样1ml，按平皿计数法测定，计算回收率离心机型号转速（rpm）时间(min)试验菌回收率（%）第1次第2次第3次平均DT5-6RCF(27g)500、39800141554045500、533302830500、36350186908687500、5868685862021年版微生物限度检查法修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代〔从菌种保存中心获得的冷冻枯燥菌种为第0代〕，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌〔Escherichiacoli〕〔CMCC〔B〕44102〕金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕〔CMCC〔B〕26003〕枯草芽孢杆菌〔Bacillussubtilis〕〔CMCC〔B〕63501〕白色念珠菌〔Candidaalbicans〕〔CMCC〔F〕98001〕黑曲霉〔Aspergillusniger〕〔CMCC〔F〕98003〕2021年版微生物限度检查法修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改进马丁培养基或改进马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改进马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，参加3～5ml含0.05％〔v/v〕聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％〔v/v〕聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌悬液制备后应在2小时内使用，假设保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。计数培养基适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48hr，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20～25℃培养72hr，计数；取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20～25℃培养72hr，计数。同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

结果判定被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养的适用性检查符合规定。

被检培养基菌落数

琼脂培养基回收率=——————————*100%

对照培养基菌落数2021年版微生物限度检查法修订13、附录110页，增加：控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查工程包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。大肠埃希菌〔Escherichiacoli〕〔CMCC〔B〕44102〕金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕〔CMCC〔B〕26003〕乙型副伤寒沙门菌〔SalmonellaparatyphiB〕〔CMCC〔B〕50094〕铜绿假单胞菌〔Pseudomonasaeruginosa〕〔CMCC〔B〕10104〕生孢梭菌〔Clostridiumsporogenes〕〔CMCC〔B〕64941〕白色念珠菌〔Candidaalbicans〕〔CMCC〔F〕98001〕控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌MUG培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基促生长能力乙型付伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌吐温80玉米琼脂培养物促生长能力+指示能力白色念珠菌2021年版微生物限度检查法修订16、附录111页，增加：白色念珠菌取供试液10ml〔相当于供试品1g、1ml、10cm2〕直接或处理后接种至适量〔不少于100ml〕的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48小时〔必要时延长至72小时〕。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，外表光滑有浓酵母气味，培养时间稍久那么菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。假设平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时〔必要时延长至72小时〕。假设平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。假设平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养24～48小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。芽管试验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。假设上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。理由:

白色念珠菌〔Candidaalbicans〕，又称为白假丝酵母菌〔Saccharomycesalbicaus〕，属假丝酵母菌属〔Saccharomyces〕。白色念珠菌是条件致病菌，是医学全身性真菌感染病的重要组成之一，一旦感染，常可引起心内膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎及败血症等。

白色念珠菌广泛分布于土壤、水和空气中，目前国内的药品、食品标准均已把白色念珠菌作为微生物检验中酵母菌的代表菌，因此有些药品依据给药途径和剂型将白色念珠菌作为控制菌是非常必要的。

(三)微生物检查方法验证试验

无菌/微生物限度检查理念环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断充分重视微生物检查的重要性充分重视微生物检查方法的合理性如何推进微生物检验技术的开展？——?方法验证?关于方法验证为什么验证?验证什么?怎么验证?何时验证？关于方法验证?中国药典?2005版首次引入方法验证要求；?中国药典?2021版无菌检查法和微生物限度检查法延续了2005版方法验证要求；?中国药典?2021版?微生物限度检查法应用指导原那么?〔一部附录XVIIIF、二部附录XIXP〕第五条。为什么验证?1、采用经过验证的方法，是分析测量科学的根本要求，是各种法规遵循工作的根底。药品微生物检查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他检验工程一样，对方法和条件进行考察，以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。2、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多方面：无菌环境验证〔尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测〕、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性对照、阳性对照等等。为什么验证?3、2005版充分借鉴兴旺国家经验，将微生物检查方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明〔验证〕，保证其对结果判断没有影响。4、有了系统的方法验证，可以防止以往因为阳性菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以及新的药品注册管理方法的要求都是相一致的。5、通过对同品种但不同批号或不同生产厂家的产品的微生物学验证试验比较，可以发现产品所用原料质量或工艺流程中是否存在污染抑菌物质的问题，具有药品质量控制的意义。例：盐酸利多卡因注射液要求执行验证的相关法规和文件

为了确保开展微生物学检验方法的验证，国食监注〔2005〕234号“关于公布和执行?中国药典?2005年版有关事宜的通知〞国药典发〔2005〕98号“关于执行?中国药典?2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明〞中检药〔2006〕862号“第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要〞都作了说明和规定。验证什么？无菌、微生物限度检查的验证试验可概括描述为：在采用的检验方法和过程中，通过分别参加规定量的代表性微生物，以试验供试品是否在规定的检验量、在所采用的检验条件下无抑菌性，或已充分消除了抑菌性，并且所用方法对微生物生长无不良影响，从而确认检验方法的有效性，保证检验结果的准确可靠。因此，整个实验过程中的每一个环节均应有合理的证明，保证其对结果判断没有影响。按样品的检验流程，验证的重点环节分布如下：验证什么？需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用样品检查去除抑菌作用①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。③验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。②可以通过验证实验判断

药品微生物检查方法验证的一般程序与环节验证什么？

——需要验证的重点环节验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明〔验证〕，保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证范围内。已有标准规程〔SOP〕和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究提高。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。怎么验证？利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。稀释法薄膜法中和法离心法供试品前处理去除抗菌活性稀释溶解分散萃取离心供试品污染微生物检查验证供试品中抗菌活性的去除稀释法——降低供试品的相对浓度薄膜法——利用体积差异别离中和法——利用化学〔生物〕专属性灭活离心法——利用沉降系数差异别离各方法组合运用，效果更佳！抗菌活性去除效果的检验应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对供试品抗菌活性去除效果加以检验，再按药典要求全面验证，提高效率。选择敏感菌株查阅资料——临床药物实验手册、文献资料、申

报资料中的药效学资料参考已经验证过的品种直接通过验证实验确定

选择适宜的方法可靠、稳定、简便参考方法：在样品许可的条件下无菌：薄膜过滤，500ml/膜冲洗；限度：薄膜过滤，300ml/膜冲洗。结果总结与报告综合分析实验中遇到的所有情况，最终形成一份详细、严谨、具有可操作性的验证报告。给出该品种的标准检验规程，规程中应明确样品前处理步骤、采用的具体方法，以及各方法操作的关键点，以供检验参考。方法验证实验报告——标准的技术文件。无菌检查方法验证的思路

验证体系：阴性对照、阳性对照、微生物挑战试验通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性来检验微生物的方法，应通过验证，以确定所用检验方法测定结果的可信度无菌检查方法验证的思路利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验依据抗菌谱通过预实验确定敏感菌株〔阳性对照菌〕通过敏感菌株确定冲洗量通过方法验证验证该取样量以及冲洗量下敏感菌株生长情况确定试验方案进行检验影响无菌检查方法验证结果的环节

供试液的制备冲洗条件中和剂的选择与参加敏感菌株的选择与参加标准化操作影响无菌检查方法验证结果的环节供试液的制备

供试液浓度过高增加了滤膜的初始吸附量，从而导致了后期冲洗体积的增大，因此将供试液浓度控制在一定范围之内有助于提高无菌检查方法的科学性供试液的影响左奥硝唑注射液〔水针〕规格：10mL：0.25g/支生产企业：衡阳恒生制药注射用盐酸克林霉素〔粉针〕规格：0.3g/支生产企业：北京四环科宝制药左奥硝唑注射液〔10mL：0.25g/支〕取样量及样品浓度每张滤膜样品量每张滤膜冲洗量阳性对照菌（生孢梭菌）生长情况每张滤膜通过量10ml×10支C：250mg/ml33ml800ml－－＋833ml1000ml－＋－1033ml10ml×10支溶解于500ml0.9％NaCl溶液C：4mg/ml200ml300ml－＋－500ml400ml＋－－600ml注射用盐酸克林霉素〔0.3g/支〕取样量及样品浓度每张滤膜样品量每张滤膜冲洗量阳性对照菌(金黄色葡萄球菌)生长情况每张滤膜通过量0.3g×15支每支溶解于5ml0.9％NaCl溶液C：60mg/ml25ml800ml－－－825ml1000ml－－－1025ml0.3g×15支全部溶解于500ml0.9％NaCl溶液C：3mg/ml167ml400ml－＋－567ml500ml＋－－667ml无菌三针单联管

----溶解稀释供试品影响无菌检查方法验证结果的环节冲洗条件

主要是冲洗体积对于无菌检查方法的影响，冲洗体积过大滤膜的截留能力会降低，导致无菌检查假阴性结果的出现

建议冲洗量控制在1000ml/膜以内冲洗量的影响性试验指征菌：粘质沙雷〔Serratia

marcescens〕注：又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。革兰氏阴性，周身鞭毛,能运动。无荚膜，无芽胞，在普通琼脂平板上25～30℃培养1～2天出现粘性、中心颗粒状、有恶臭的菌落。约半数菌株能产生红色的灵菌素(prodigiosin)。在室温条件下易促进色素的生成，因本菌小且有色素，常用于检定滤菌器的质量。操作步骤：

1.湿润滤膜

2.参加适量指征菌

3.用不同冲洗量对滤膜进行冲洗

4.平行进行阳性对照

5.取膜培养

6.计算回收率冲洗量的影响性试验冲洗量的影响性试验冲洗量持续冲洗CFU及回收率分次冲洗(100ml/次)CFU及回收率阳性对照组CFU400ml72cfu82％80cfu91％88cfu600ml66cfu75％75cfu85％800ml50cfu57％69cfu78％1000ml33cfu38％62cfu71％1200ml20cfu23％35cfu40％影响无菌检查方法验证结果的环节中和剂的选择与参加

选择：对应的理化特性作为选择依据，如β－内酰胺酶、MnSO4；应对微生物的生长无影响。

参加：不同中和剂参加方式效果不一样。通过我们的经验，根本倾向于直接参加培养体系中。影响无菌检查方法验证结果的环节敏感菌株的选择与参加

选择：根据抗菌谱和预试验〔体外抑菌试验〕

参加：按规定应在最后一次冲洗液中参加阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。影响无菌检查方法验证结果的环节标准化操作

供试液制备：通过比较发现，在检验条件下，0.9%氯化钠溶液对大多数的抗生素粉针比0.1％蛋白胨溶液溶解能力强、溶解速度快。

冲洗方法：少量屡次、充分震摇、冲洗体积的控制

中和剂和阳性对照菌的参加方式样品量以及供试液浓度确实定出厂检验量远远高于上市抽验量，样品量的增加是否会直接导致冲洗量的增加？冲洗只能让样品的吸附量降至最低值，即