(毕业论文)林蛙皮中提取胶原蛋白的方法比较正文终稿

长春工业大学毕业论文PAGE31摘要中国林蛙，属于两栖类珍稀动物。中国林蛙以其独特的营养价值与药用价值日益受到人们的重视，是蛙类中最有经济价值的一种。林蛙富含多种氨基酸、激素、微量元素和维生素等营养成分，在药用、滋补和美容等方面都具有非常高的利用价值。林蛙皮是摘取林蛙油后作为饲料或废弃物的物质。本研究立足于中国林蛙资源丰富以及蛙皮中含有大量生物活性物质这一优势，以干燥的林蛙皮为原料，用不同方法对林蛙皮进行胶原蛋白提取试验，利用羟脯氨酸比色法比较了几种方法的提取效果，得出最佳的提法方法，并通过单因素试验及正交试验对最佳提取方法进行优化。结果表明：酸法浸提是从林蛙皮中提取胶原蛋白的最佳方法，液料比为20:1，利用0.1mol/L柠檬酸在37℃下浸提48h为最佳工艺条件。关键词：林蛙皮；胶原蛋白；方法比较；最佳工艺

AbstractRanachensinensis,belongstotheamphibianofrareanimals.Theranachensinensishasbeenpaidincreasinglyattentionbypeoplewithitsuniquenutritionvalueandmedicinalvalue,andbecomesoneofthefrogswhichhavemosteconomicvalue.Ranaisrichinaminoacids,hormones,traceelements,vitaminsandothernutritions,andhasveryhighvalueintheuseofpharmaceutical,tonic,cosmeticandotheraspects.Ranaskinisgatheringafterranaoilasfeedorwastematerial.Thisstudybasesontheadvantagethatranachensinensisresourcesarerichandranaskincontainsalotofbiologicalactivesubstance,withdryranaskinasrawmaterials,usingdifferentmethodstotheextractiontestbyranaskincollagen,thencomparedseveralmethodsofextractioneffectbyhydroxyprolinecolorimetricmethodtogetthebestextractionmethod，andthroughthesinglefactorexperimentandorthogonalexperiment,thebestextractionmethodisoptimized.Theresultsshowthat:acidextractionisthebestmethodofcollagenproteinextractedfromthefrogskin,liquidtosolidratio20:1，using0.1mol/Lcitricacidin37℃soaksraises48histhebesttechnologicalconditions.Keywords:Ranaskin;collagenprotein;comparisonofmethods;besttechnologicalconditions

目录TOC\o"1-3"\h\u25947摘要 I3044Abstract II21309目录 III1922第一章前言 123089第二章文献综述 2103332.1林蛙皮 3279362.1.1林蛙皮的功能 3192462.1.2林蛙皮中胶原蛋白 5157312.1.3林蛙皮研究现状和应用前景 6197192.2胶原蛋白 720682.2.1胶原蛋白的结构 77072.2.2胶原蛋白的功效 850252.2.3胶原蛋白的应用 1143362.2.4胶原蛋白的发展趋势 13126002.3胶原蛋白的提取方法 14204692.3.1酸法 14236672.3.2碱法 1416692.3.3酶法 14155162.3.4盐法 14216672.3.5热水法 1561712.4本论文的研究内容及研究意义 1515293第三章实验部分 1652863.1材料与设备 16216753.1.1原材料 16127463.1.2主要仪器 1627083.1.3主要试剂 1663253.2林蛙皮中提取胶原蛋白试验方法 17107553.2.1胶原蛋白的提取工艺方法 17295573.2.2对二甲氨基苯甲醛法测定林蛙皮中胶原蛋白的含量 17198993.3结论与讨论 19202293.3.1羟脯氨酸标准曲线的绘制 19161343.3.2胶原蛋白提取的试验结果比较与讨论 20263293.4最佳提取方法的工艺优化 21198543.4.1酸法提取溶剂的选择 21281153.4.2单因素试验 227793.4.3正交试验 2518365第四章结论与展望 27310464.1结论 27327054.2展望 273388致谢 2827511参考文献 29长春工业大学毕业论文第一章前言中国林蛙（Ranachensinensis），是我国山区，尤其是东北山区，包括长白山脉、小兴安岭大部、张广才岭腹地，纯野生动物，亦被称作哈什蚂（哈士蟆）。其与蛤蟆、田鸡完全是非同原动物。唯中国仅有，已被列为易危物种。是集药用、食补和美容功能于一体的珍稀两栖类动物[1]。中国林蛙凭借其特有的营养价值与药用价值日益受到人们的重视，成为蛙类中最有经济价值的一种。在各地所产的林蛙中，以东北地区的林蛙体格大、产油率高、体制健壮、繁殖率高而成为林蛙中的极品。中国林蛙富含18种氨基酸、4种激素、13种微量元素和9种维生素[2]，在药用、滋补和美容方面都具有非常高的利用价值。林蛙的营养价值比较高，俗称“大补品”。由于其主要以昆虫类为食，因此又称“农林卫士”和“纯绿色食品”，在近些年市场上显现出了巨大的商机。中国林蛙皮中含有丰富的胶原蛋白资源。胶原蛋白富含除半胱氨酸和色氨酸外的18种氨基酸，其中有7种是维持人体生长所必需的氨基酸，在胶原蛋白中甘氨酸占30％，而脯氨酸和羟脯氨酸含量共占约25％，是各类蛋白质中含量最高的，此外，丙氨酸和谷氨酸的含量也都比较高[2]，同时胶原蛋白还含括了一般蛋白质中极少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸以及在其他种类蛋白质中几乎不存在的羟基赖氨酸。有资料报道：胶原蛋白肽可以被人体主动且无障碍吸收[3]。由此可见，胶原蛋白具有十分丰富的营养。本课题立足于中国林蛙资源丰富以及蛙皮中含有大量生物活性物质这一优势[4]，以干燥的林蛙皮为原料，对从林蛙皮中提取胶原蛋白相关提取方法比较做重点研究。目前广泛采用的提取胶原的方法主要分为酸法、碱法、酶法、盐法以及热水浸提法5类。本课题以干燥的林蛙皮为原料,研究其胶原蛋白的酸法、碱法、酶法、盐法及热水法提取工艺条件,对比不同提取方法提取得到的胶原得率，比较出最佳的胶原提取方法，并通过单因素试验及正交试验对最佳的提取方法进行优化，从而得出最佳的工艺条件。

第二章文献综述中国林蛙（Ranachensinensis），俗称哈什蟆，在分类上属于两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属[2]，主要分布在中国东北山区，包括长白山脉、小兴安岭大部等地，是纯野生动物，为国家二级保护动物[1]。中国林蛙与蛤蟆、田鸡完全是非同原动物。近年来由于过量捕获，林蛙已被列入《中国濒危动物红皮书》，为易危（v）物种[1]。中国林蛙是集药用、食补和美容功能于一体的珍稀两栖类动物。中国林蛙凭借其特有的营养价值与药用价值日益受到人们的重视，成为蛙类中最有经济价值的一种。在各地所产的林蛙中，以东北地区的林蛙体格大、产油率高、体制健壮、繁殖率高而成为林蛙中的极品。中国林蛙富含18种氨基酸、4种激素、13种微量元素和9种维生素，在药用、滋补和美容方面都具有非常高的利用价值[2]。林蛙的营养价值比较高，俗称“大补品”。林蛙全身是宝：这其中林蛙皮是高级制革业的主要原材料；林蛙卵中富含卵磷脂和性激素；林蛙肉凭借其低脂肪、高蛋白的特性可加工成高级保健品[5]；林蛙雌蛙输卵管的干燥物即林蛙油，又称哈什蟆油，是极其珍贵的药材[6]。哈什蟆油是我国医学中记载使用的滋补强壮之药物，有补虚、增精、解毒、退热、消肿、润肺、益肝肾、健脾胃之功效，可治疗神经衰弱、失眠眩晕、脾胃虚弱、体弱气虚、咳嗽肺虚、创痛肿毒、水肿腹胀、肝炎和疮疾、肺结核等疾病[2]。此外，提取到林蛙油后的副产品，如骨骼、内脏、肌肉等也可作为毛皮动物的饲料，又可浸泡后入药。林蛙除了药用、美容、保健、饲料价值外，在中国东三省和广东、台湾及东南亚等地又被人们充分的认可，具有纯天然的绿色的药用和食用价值，因而，具有广泛的消费市场。中国林蛙中雌蛙体长约为75mm左右，雄蛙体长较小；林蛙的头部很发达，位于身体的前端，背面观呈三角形，扁而宽，头长路小于头宽，头长与体长相比较，为体长0.32-0.38倍；林蛙的口宽阔，位于吻端腹面，吻尖，向前突妯，略长于下颌，吻端上方有一对外鼻孔，其上有瓣膜，可随时开闭，以控制气体进出，头两侧有大而凸出的眼，眼有上下眼睑，下眼脸的上方有二层折叠的眼睑，可以上下移动遮着眼球以适应陆地生活，两眼后方各有一圆形鼓膜、遮着鼓室并传导空气中声波产生所觉；雄蛙在鼓膜后的两侧各有一个声囊；林蛙的躯干部自颈椎部起至体后端正中部分，即鼓膜之后为躯干部，是身体各部分中最大的一段，短而宽，躯体腹部较膨大，雌性比雄性大，没有明显的颈部，末端有二个泄殖腔孔，为泄殖腔的开口；林蛙的前肢由上臂、前臂、腕、掌、四指组成，短而细，上臂部与手部长度相比，上臂略短于手长，指瑞无爪并钝圆，关节下瘤、趾基下瘤及内外掌突均明显，指间无蹼，指长顺序为3、1、4、2；前肢背面有3-4条环形黑斑，雄蛙第一手指内侧有一瘤状物为软婚垫；林蛙的后肢发达，由股、胫、跗、五趾组成，其长度为前肢的2.5-2.7倍，胫长超过体长之半，后肢拉直前伸，即胫跗关节前伸可超过眼部，伏卧时两后肢的脚跟部常相互重叠，膝部内侧有一明显的突起；趾细而长，具五趾，第1脚趾很短，第4趾特长，为第1趾长的4倍，趾长顺序为4、5、3、2、1，趾间有蹼，很发达，呈薄膜状，蹼殊缘有浅凹，除第4耻外均达趾端，蹼膜宽顺序为5-4、4-3、3-2、2-1，后肢肌肉发达；因此，林蛙善于跳跃、游缺、攀登、爬行。2.1林蛙皮2.1.1林蛙皮的功能中国林蛙皮在生命停止后，无论在水中泡或是烈日下晒，还是在阴干的地方存放，它的形体几十年不会变质、不会霉烂。冬季东北林蛙在河水冻成冰时，由于胸腹呼吸困难，因此可用皮肤进行呼吸，夏季在进入森林中，用皮肤从土地中、露水中吸水，其性格被堪称动物中典范。(1)林蛙皮的保湿功能林蛙可以用皮肤呼吸并吸收水分，其机体具有完善的保湿系统，林蛙的某些组织中天然保湿因子含量较高，尤其是保湿因子的典型代表物透明质酸(Hyaluronicacid，HA)的含量与牛眼玻璃体中HA的含量接近，而牛眼玻璃体中HA的含量是至今为止动物性原料中HA含量最高的。HA是目前世界公认的性能优越的保湿因子，其分子中的羧基和其他极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，当含量低于0.1％时，HA可结合其质量1000倍的水。这种天然保湿因子可使皮肤含水量增加，表皮角质层柔软，改善皮肤表面的血液循环，增强皮肤弹性，阻止表皮细胞纤维化，从而起到护肤作用。HA是皮肤固有的生物物质，当皮肤所含HA浓度下降时，可导致皮肤干燥和皱纹的产生，而通过口服或涂抹HA，可增加体内HA及其合成前体，从而有效改善皮肤的保水性和弹性。HA可维持眼玻璃体呈胶凝状，明显延长泪膜破裂时间，是治疗干眼病的首选药物，还可应用于眼科手术的粘弹性填充剂。HA在皮肤中可清除阳光中的紫外线照射所产生的活性氧自由基，保护皮肤细胞免受其害，可有效抑制由于自由基侵害而出现的皮肤衰老及色素沉淀的出现，提高皮肤的抗病能力。人们以雄性林蛙皮及摘油后的雌性林蛙皮为原料，采用复合酶解进行天然保湿因子的提取和纯化，最终得到HA纯品。HA目前的市售价格为雄性林蛙及摘油后的雌性林蛙胴体价格的11300倍以上，因此林蛙皮的利用为提高林蛙产品的附加值，实现其高附加值综合利用开辟了一条新途径。(2)林蛙皮的治疗痤疮功能痤疮俗称“青春痘”，是最常见的毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病。中国医学研究表明：痤疮虽生长在皮肤表面，但与脏腑功能失调息息相关；西医认为痤疮与内分泌失调有关，此外与神经精神因素、饮食因素、大便睡眠等个人行为因素、烟酒等嗜好因素、药物因素、化妆品及皮肤护理因素等诱因有关。研究表明，大孔多肽因子为蛙皮的有效成份且具有广谱杀菌的功效，可有效的杀灭由皮肤表层引起的豆口、痤疮而产生的细菌，在加上其保湿因子的作用，使皮肤表面温度上升、表皮角质层柔软、血液的循环得到改善，进而可以达到治疗痤疮、皮肤湿润祛斑的目的。(3)林蛙皮的祛斑功能斑是困扰人们的一种皮肤疾病。斑产生可能有遗传、内分泌失调、日晒衰老等多种原因。林蛙皮的透明质酸HA在抗氧化试验中表现出了与谷胱甘肽等非酶自由基清除剂相同的作用，所以它具有对理想细胞的保护作用，可以延缓因为自由基的侵害而引起的色素沉着和皮肤衰老，并可以改善皮肤的新陈代谢，以此加速皮肤中黑色素的分解，达到提高皮肤抗病能力的作用，从而具有祛斑的功效。

(4)林蛙皮的祛皱功能研究结果表明，林蛙皮中胶原蛋白的含量可达48％，而多肽类的含量可达10％以上。林蛙皮中的胶原蛋白，经过口服吸收，可以有效的补充人体衰老的肌肤中流失的胶原蛋白，能提高皮肤弹性，并且能减少皱纹生成。此外，林蛙皮中保湿因子--透明质酸HA可以有效提高皮肤中保湿因子的含量，增强皮肤的保水性，并能够减少由紫外线照射而产生的自由基损害皮肤，可提高皮肤的抗病能力。综合以上结果，胶原蛋白可以减轻皮肤的衰老症状，使皮肤逐渐恢复原有弹性。

林蛙皮中含有大量的多肽类成分，可以防治自身受感染。它的皮腺内包含各种活性因子，其包括多肽生长因子、保湿因子、血管紧张素因子、林蛙生物抗菌因子、舒缓激肽样多肽、铃蟾肽类因子、吗啡因子、促甲状腺素肽类等14种多肽类因子。研究表明，林蛙皮当中抗菌多肽有广谱抗菌作用，其包括对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌特别对耐药株有明显的抑制作用，还可杀灭皮肤当中各种有害的细菌，有助于减少青春痘生成，并且以不损害真核细胞为前提对癌细胞、病毒和真菌有抑杀作用。亦可用来治疗肠炎、痢疾、胃痛等某些炎症类的疾病。在世界范围内林蛙油保健效果已得到普遍的共识，林蛙皮当中的活性成分同林蛙油类似，即可促进细胞的修复，亦可延缓组织细胞的衰老。当代研究证明，林蛙皮的成分组成当中含有不同种类的活性因子，它的作用是由一种或几种生长因子协同作用诱导细胞DNA的分裂和合成。林蛙皮当中含有蛙皮素，含丰富的脯氨酸抗菌肽可以预防创面感染，它的特点是抗菌谱广，并能在几分钟或几小时内杀死病原菌，且对正常细胞是没有害的。林蛙的活性蛙皮在治疗创伤的过程中，即有抗感染又有止痛、止血、透气、保湿和隔绝创面的作用，可以代替传统的敷料，一方面主动参与，促进创面愈合；同时，可以覆盖创面，是一种新型的胶体生物敷料。成纤维细胞作为机体内极为重要的一种细胞，在创伤愈合和组织修复等过程中起着至关重要的作用。随着年龄的增长人体内透明质酸HA的含量逐渐降低，极可能与老化时皮肤弹性的下降有关。林蛙皮当中胶原蛋白的含量可达到48%，多肽类得含量可达到10%以上，透明质酸（HA）的含量极为丰富，这几种成分则是成纤维细胞生长繁殖所必需的基质。人类的皮肤内透明质酸HA伴随着衰老，特别是光导致的老化，透明质酸（HA）的含量会逐渐减少，同时皮肤的保湿能力也有所下降。在机体内透明质酸HA以它特有的理化性质和分子结构成就了很多重要的生理功能。它具有特殊的持水作用，是当前发现的在自然界中保湿性最佳的一种物质，故被称为理想天然保湿因子（NMF)。人类皮肤的成熟和老化过程亦随着透明质酸（HA）的新陈代谢和含量多少而变化，适当的补充透明质酸（HA）可以改善皮肤的营养代谢，从而使皮肤去皱、光滑、柔嫩、提高弹性、预防皮肤衰老。通过研究可知，林蛙皮的提取液能显著提高成纤维细胞增殖，其中透明质酸HA成分极可能起重要作用，从而进一步证明林蛙皮可以促进伤口愈合、恢复衰老皮肤的弹性以及治疗烧伤等过程作用机制，成为林蛙皮应用于临床的理论根据。2.1.2林蛙皮中胶原蛋白林蛙皮中的胶原蛋白：胶原蛋白是一种生物性高分子物质，英文学名Collagen。在动物细胞中扮演结合组织的角色。为生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳生物医药材料。其应用领域包括生物医药材料、化妆品、食品工业、研究用途等。林蛙皮中含有许多生物活性物质，其中胶原蛋白就是其中之一，且含量十分丰富。近些年，关于林蛙皮中胶原蛋白提取和研究受到广泛关注。胶原蛋白是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维能使皮肤保持结实而有弹性。它存在于人体皮肤、骨骼、牙齿、肌腱等部位，主要生理机能是做结缔组织的粘合物质。在皮肤方面，它与弹力纤维合力构成网状支撑体，提供真皮层安定有力的支撑。随着年龄的增长，人体胶原蛋白含量会逐渐流失，网状支撑体亦会渐渐变厚变硬、失去弹性，当真皮层的弹性与保水度降低，皮肤便会失去弹性并变薄老化，同时可导致真皮的纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少，使皮肤出现色斑、皱纹等一系列老化现象，显出老态。胶原蛋白是人体皮肤的主要成分，占人类皮肤干重70%-80%。医学研究提示；胶原蛋白中的羟脯氨酸是人体皮肤形成的关键物质。胶原蛋白在结缔组织与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成的网状结构，产生一定的机械强度，是承托人体曲线，体现挺拔体态的物质基础。胶原蛋白还能保持血管壁弹性，防止血管破裂，栓塞。提高关节、软骨以及韧带的润滑，减轻关节僵硬、酸痛、积水等症状。胶原蛋白（英文“collagen”）是一种天然存在的无支链的纤维蛋白质，主要存在于动物的皮、骨、肌腱等组织中，是人体和脊椎动物的主要结构蛋白，起着支撑器官、保护机体的作用。胶原蛋白是体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白总量的25%-30%，相当于体重的6%。近年来，随着胶原蛋白提取技术的发展和结构、性质等方面的深入研究，胶原蛋白水解产物和多肽的生物功能也逐渐得到了广泛的认同，胶原蛋白作为天然的生物资源具有优越的生物相容性和生物可降解性，使其在食品、美容美体、医疗保健等领域都有着广泛的应用[7]。2.1.3林蛙皮研究现状和应用前景东北林蛙皮成份组成中含有活性因子,它是蛋白质和肽类，其作用是一种或几种生长因子的协同作用来诱导细胞DNA的合成和分裂，其结构与人体生物皮类同。目前，国内学者对此已有所熟悉，如：血小板来源的生长因子、血管内皮因子、酸性或碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、转化生长因子、生物抗菌因子等，某些生长因子也有趋化作用。血管内皮生长因子，是迄今为止发现的作用最强的血管形成因子。可防止创面感染，其特点是抗菌谱广，能在几分钟或几小时内杀死病原菌，而且对正常细胞是无害的。东北林蛙活性蛙皮在治疗创伤中，即有隔绝创面又有止血、止痛、保湿、透气、抗感染的作用，是不可多得的生物敷料。可代替传统敷料，它一方面可以覆盖创面，同时，主动参与和促进创面愈合，是一种新型胶体生物敷料。同时林蛙皮中含有丰富的透明质酸，HA是一种高分子量的直链多糖，由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸二糖单位重复交替连接形成。HA广泛的分布于动物和人体的结缔组织中，但不同组织来源的HA化学结构完全相同，只是在含量多少和相对分子量大小上存在差异，没有种属特异性。经过多年的研究，人们对HA的结构、理化性质及生理功能已有了明确的认识。它在水溶液中的无规则卷曲状态和它的流体动力学特点赋予其重要的物理特性，即高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，作为一种可吸收、可降解的生物材料，其应用研究领域不断扩大，表现出良好的市场前景。由于HA具有保湿功能，广泛用于化妆品和口服美容保健食品中；作为粘弹性保护剂，用于眼科手术和关节疾病的治疗；作为媒介在滴眼液中广泛应用；交联的HA在粘连的预防和软组织修复等应用中获得成功；HA与其他药物反应形成的加合物对药物发挥控释作用，可达到定向和定时释放的目的。林蛙皮表面湿润、裸露，为抵御环境有害因子侵袭，在自然选择的过程中，经长期进化，其皮肤分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性物质。此种物质能抑制部分菌种的生长，可以将其开发为低毒、高效药用资源或食物保鲜剂。目前，国内针对中国林蛙的研究多见于雌性东北林蛙输卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的报道，而对东北林蛙皮肤活性物质的研究少有报导。蛙类皮肤中含有丰富的具有特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性物质，具有重要的应用价值及较大的开发利用潜力。国外对蛙类皮肤中的活性多肽的研究有40多年的历史。从70年代开始，就已大规模地从两栖类动物皮肤及其分泌物中寻找具有药用价值的生物活性物质，已涉及到600多种蛙类，从中提取出100多种活性肽，其中对部分蛙皮多肽抗生素的结构、功能与性质等方面,已做了深入研究。这些活性肽的结构功能各不相同，其中抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点，不但能够抗细菌，而且能够抗真菌、抗原虫、抗肿瘤、抗病毒，对哺乳动物正常细胞却只有很低的毒性。可在食品工业中作为天然防腐剂加以应用。2.2胶原蛋白2.2.1胶原蛋白的结构胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。分子量为300ku。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构。其由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型。3条左手螺旋链叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构闭胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。 人体之所以能够活动自如，就是因为有关节的结构，大部分的关节，不但是提供人体活动之需，并经由软骨保护骨头避免磨损，软骨当中有65%至80%是由水所组成，其它则有醣蛋白、胶原蛋白及软骨细胞，这些提供了软骨健康营养及功能保护。事实上，软骨本身是一多孔结构，胶原蛋白是一条条细长纤维形成的网套，醣蛋白则是具有弹性的球体，水分则填塞其中，这些组成都必须完整，才可使软骨负荷重力，若胶原蛋白变少，会使醣蛋白与胶原蛋白的网套连接松弛，或是醣蛋白内含物减少，会使醣蛋白不再具有弹性，都会导致关节受力时容易变加速磨损，随着患者年龄增长，造成这些材质自然消失或者功能退化，就形成所谓的退化性关节炎。所以银发族、更年期妇女、运动过度者、骨折者或关节容易酸痛者应多补充富含胶原蛋白之食物。2.2.2胶原蛋白的功效胶原蛋白对皮肤的作用胶原蛋白是人体皮肤真皮层的主要组成部分，它具有将水分保留在真皮层的作用，并提供支持和保护，赋予皮肤弹性和强度。随着年龄的增长，肌肤中的胶原蛋白会慢慢代谢减少，此外紫外线通过表皮达到真皮层，促使胶原蛋白分解。皮肤中缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生联固化，使细胞间粘多糖减少，皮肤便会失去柔软、弹性和光泽，同时真皮的纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少，皮肤会出现色斑、皱纹等一系列老化现象。胶原蛋白对骨骼的作用骨骼中胶原含量约占20%，约占骨中总蛋白含量的80%。胶原蛋白可使钙质与骨细胞相结合。钙对于骨骼来说非常重要，骨骼中钙的流失直接导致骨质疏松。因此，当钙流失时，若只增加钙的摄取量是无法改善这种骨质疏松现象的，因为钙无法在骨中得到保存。这时想要保住骨本就必须先补充胶原蛋白。另外，胶原蛋白还能使骨骼与牙齿更坚硬、有弹性。骨骼与肌肉的相互联接也靠胶原蛋白，这里的胶原蛋白称为肌腱。骨与骨之间相连接的部分（如膝盖和关节等软骨组织）的主要成分也是胶原蛋白，它使得人在做运动时筋骨能够保持柔软且有弹性。在一般动物的筋骨中，也含有许多胶原蛋白称为“骨胶原”。因此，可以从动物的筋骨中抽取胶原用作医药及工业用途[8]。胶原蛋白对眼睛的作用胶原蛋白是眼角膜的主要成分蛋白质，眼角膜中所含胶原纤维呈现规则排列，这种结构不但可使让光线透过，还可令眼角膜呈现透明。圆锥角膜是一种眼科疾病，其机械强度要比正常角膜低，有研究表明通过核黄素及UV-A照射后得到的交联的角膜胶原能够增加角膜基质的硬度，阻止圆锥角膜的进一步发展。目前，还出现了以胶原蛋白为材料制成的隐形眼睛，能提高眼睛的保水力。此外，人体主要的内脏器官、组织中都含胶原蛋白，其最大的功能在于保护和强化脏器，但不同器官、组织中胶原含量不同[8]。抗氧化自由基可攻击生命大分子物质及细胞壁，造成机体的多种损伤和病变，加速机体的衰老。在正常生理状态下，机体内自由基的产生与清除处于动态平衡状态，但当机体处于不良环境状态下，以及随着年龄的增长，体内的自由基将会产生过多或清除过慢。自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内过剩的自由基，减轻它们对机体的损伤。自由基在体内增加时，可作用于机体细胞的生物大分子(蛋白质、核酸、脂类等)，使大分子受损，从而引起疾病和衰老。自由基在生物体内对氧化和衰老起巨大作用，有效地清除超氧化自由基对抗氧化和抗衰老有积极地作用。MendisE等人利用三种商品酶对Hoki(Johniusbelengerii)鱼鳞水解，然后检测产生的胶原多肽的自由基清除能力。结果证实，胰蛋白酶水解所得的胶原多肽具有最强的自由基清除能力。并分离出了具有最强自由基清除能力的一个肽段，其序列为His-Gly．Pro-Leu．Gly．Pro．Leu（797Da）。而且，这个肽段对亚油酸自氧化的抑制能力接近BHT。进一步研究证实，该肽段可以提高人的肝细胞中抗氧化酶的水平。经推测认为，该肽段可能与维持细胞环境氧化还原的平衡有关[9]。董玉婷研究了鳕鱼皮胶原蛋白水解产物的抗氧化活性，发现不同分子量的鳕鱼皮胶原多肽对羟基自由基和超氧阴离子都具有清除活性，分子量越低，活性越高。在相同浓度下，各多肽组分对羟基自由基的清除活性较超氧阴离子自由基高[10]。Jing-longYang等人分析军草鱼皮中明胶水解产物的特性及其抗氧化活性，得到酶水解后的鱼皮明胶水解物分子量范围在700Da．6500Da之间。其分子量大多在700Da以下的水解产物抗氧化能力显著提高[11]。减肥降血脂减肥需要分解脂肪(分解代谢)，而胶原蛋白能激活脂肪酶的活性，使这种分解代谢过程增加和延长。汪静慧等人研究水产胶原肽对小鼠营养性肥胖的预防作用，发现水产胶原肽可以明显减少小鼠因高脂饮食导致的体重增加，对小鼠营养性肥胖的预防作用显著，对肝肾无损害并能减轻有害物对肝细胞的损伤[12]。中国科学技术大学的黄碧霞等曾对补充了氨察，发萎现可加速人体的血清譬白蛋白、喜自细胞、血小板和红细胞的生成，有明显的提高免疫功能与改善心肌能的作用，调节血胆固醇和甘油三酯的作用[13]。降血压高血圧是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象——心脏病发作、脑血管破裂而导致死亡。据国家高血压研究中心统计，我国高血压患者己达1.2亿人，发病率为l0.8％其危害仅次于肿瘤。因此，治疗和防治高血压病是当今社会关注的一个热门课题。许多医学研究和临床观察表明，高血压的发病与血管紧张素转换酶(Angiotenisinconvertingenzyme，ACE)密切相关。国内外相关研究证明，胶原蛋白水解产物中的一些多肽对血管紧张素转换酶的活性具有较强的抑制作用，具有良好的降压效果。赵元晖从海地瓜水解胶原蛋白中提取血管紧张素转换酶抑制肽，得到的肽主要由Glu、Asp、Pro、Gly、Ala这5种氨基酸组成，分子量在410-950Da之间[14]。陈胜军等人探讨了酶水解罗非鱼鱼皮胶原蛋白制备抑制血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)的工艺条件，采用双酶复合水解工艺所得水解产物的水解度为30.43％体外对ACE的抑制率达68.6％[15]。林琳研究发现鱼皮胶原蛋白多肽Mw<2000Da的组分，通过长期预防给药的试验表明，可以显著的降低。肾血管性高血压大鼠的动脉血压，并能显著降低人鼠血浆中AngII的含量，具有较好的降压效果，呈剂量依赖性，200μg/g剂量的降压效果与卡托普利14μg/g相当[16]。预防疾病和术后恢复胶原蛋白能够活化细胞机能，有加速血红蛋白和红细胞生成的功能，改善循环，提高免疫力，抑制癌细胞，有利于防治冠心病、缺血性脑病。它是适于糖尿病、肾脏病等重症患者摄取的优质高蛋白。此外，胶原蛋白可协助机体排出铝元素，减少铝在体内聚积，可预防老年痴呆症。林琳研究发现，鱼皮胶原蛋白多肽对于血管内皮细胞的损伤具有一定的保护和修复作用，并且随着多肽浓度的增加，作用增强。崔凤霞对海参中胶原蛋白肽活性进行了研究，结果表明，海参胶原肽在48小时内均能显著促进OX-LDL诱导损伤的血管内皮细胞的增殖，降低细胞内MDA水平，显著提高细胞内NOS活性和NO释放量，且其作用效果随浓度的增大而增强[17]。徐彬等人对重型颅脑损伤术后病人采用富含胶原蛋白肽的肠内营养临床应用，探讨重型颅脑损伤围手术期营养治疗的有效方法，结果发现对于颅脑损伤术后患者，富含胶原蛋白肽的肠内营养，有助于降低高代谢，降低感染率，增强免疫力，有助于病情恢复，其降低病死率的效果，优于其他肠内营养[18]。其他功效水解胶原蛋白中含有大量的甘氨酸，不仅在人体内参与合成胶原蛋白，而且还是大脑细胞中的一种中枢神经抑制性传递，对中枢神经产生镇静作用，对焦虑症、神经衰弱等有良好的治疗作用。研究表明，胶原蛋白还能够减少减缓更年期妇女的更年期症状，减轻不适的感觉。胶原蛋白可以抑制胃酸和胃原酶分泌的作用，可减轻胃溃疡患者的疼痛感，促进胃溃疡愈合。此外，胶原蛋白还能够保护胃粘膜，其机理为：1．胶原蛋白可在胃内形成保护膜从而减少胃粘膜的损伤；2．提高胃粘膜cGMP/cAMP值，促进胃粘膜细胞增殖；3．缓冲胃酸对溃疡面的刺激，同时可促进血小板的凝聚而有止血作用，减轻各种因素对胃粘膜的直接损伤。胶原蛋白来源广泛，比一般药物廉价，而且是体内主要蛋白成份之一，无毒副作用，适合开发保护胃粘膜类保健食品[19]。2.2.3胶原蛋白的应用在食品方面的应用胶原蛋白本身即可作为一种食品，食用胶原一般来源于动物的肌腱、真皮及骨胶原，外观通常为白色，味道清淡，口感柔和，易消化。但大多数情况下，胶原蛋白在食品中会被作为功能物质和营养成分。（1）在功能保健食品中的应用胶原蛋白可降低胆固醇和血甘油三酯，并可增加体内缺乏的一些必需微量元素，从而使之维持在相对正常的范围，是一种十分理想的减肥和降血脂食品。胶原蛋白还有加速红细胞和血红蛋白生成的功能，可改善循环，有助于防治冠心病及缺血性脑病。胶原还可以保持血管的正常功能，与预防高血压、动脉硬化有十分密切的关系。胶原蛋白还可以包住癌细胞，抑制其增殖和转移。因此，它是适于肾脏病、糖尿病等重症患者摄取的优质高蛋白[20]。此外，胶原蛋白可以协助机体排出铝元素，从而降低老年痴呆症的发生。研究表明，胶原蛋白可以减少妇女疾病，减缓妇女更年期症状。胶原中的甘氨酸，不仅参与合成胶原蛋白，也是大脑中的一种抑制性神经递质，对于中枢神经有镇静之作用。同时，它对焦虑症及神经衰弱等也有很好的治疗作用[21]。此外，胶原蛋白食品还能抑制蛋白质因胃酸作用而引起的凝聚，有助于食物的消化，同时也有抑制胃酸和胃原酶分泌的作用，可减轻胃溃疡患者的疼痛感，以促进胃溃疡的愈合。（2）在食品添加剂中的应用酒类、饮料澄清剂鱼胶是一种功能性鱼蛋白，是由鱼体组织的胶原蛋白制成的水产品，包括粗胶、明胶和鱼漂胶。它是国际上已公认的最高级的胶澄清剂。在啤酒、葡萄酒行业明胶和鱼胶作为澄清、沉降剂获得了非常好的效果，产品质量非常的稳定。在果酒的酿造过程中也起到乳化、增黏、澄清、稳定等作用。在茶饮料生产中，明胶可用于防止因长时间存放而变混浊，可以改善茶饮料的品质。明胶可通过破坏胶原蛋白分子内部的氢键，使其原有的紧密超螺旋结构被破坏，形成结构松散的小分子，加入肉制品中可改善结缔组织嫩度，使之具有优良的品质，不仅增加了蛋白质含量，且口感好又有营养。明胶还可以作为冷冻食品的改良剂，用作增黏剂，增黏熔较低，极易溶于热水中，具有入口即化的特点，常用作粮食胶冻及果冻等。在冰淇淋和雪糕等生产中加入适量的明胶，可防止冰晶形成粗粒，保持组织的细腻并降低溶化速度。此外，胶原蛋白还有很好的染色性，可根据制品的需要，用食用色素将其染成相似于肌肉组织的红色，令消费者更容易接受。胶原蛋白经过再分解而形成的胶原多肽，拥有很好的生物功能性及较高的消化吸收性，可广泛应用于鲜牛奶、奶粉、酸奶及奶饮料等乳制品之中，起到抗乳清析出和乳化稳定的功效。胶原多肽还可以添加到面包、糕点中用于延长老化时间和增加体积及松软度，也可以添加至糖果中，令软糖果保持稳定的形态，即使承受了较大的压力也不变形。（3）在食品包装材料中的应用人造肠衣是以胶原蛋白为主制造的胶原肠衣，本身是营养十分丰富的高蛋白物质，热处理过程中，胶原几乎和肉食品的收缩率一致，其它可食用包装材料并不现具有这种优点。胶原本身具有固定化酶的功能，可改善食品尤其是肠类制品的风味与质量。人造胶原肠衣具有透明度高、口感好、制作工艺简单的特点，开发前景十分乐观。包装膜胶原蛋白可用作果脯、蜜饯的内包装膜辅，加以甘油等添加剂，提高膜机械性能的同时，也是可食性的胶原。包装膜通常具有良好的热封性、抗张强度和较高的防气、隔油、阻湿性等功效，可被广泛应用于各类食品保鲜。明胶作为涂层材料使食品表面有光泽。明胶可作为稳定剂，有防止产品干缩、变形的作用。明胶也具有保鲜作用，明胶溶液可以在果蔬的表面形成皮膜，保证食品的天然风味并延长食品的保质期。这些作用都已经得到了广泛的应用。在化妆品方面的应用目前在化妆品工业中，多种不同的蛋白质被作为原材料，其目的是保护皮肤的结构和改善其功能。胶原蛋白可作为化妆品原材料的有效性已经被确定。胶原蛋白用于化妆品中的主要功效如下：营养性可补充皮肤层所需要的养分，补充17种对人有益的氨基酸，令皮肤中胶原蛋白的活性增加，保持角质层得水分及纤维结构完整性，可改善皮肤细胞得生存环境，促进皮肤组织新陈代谢，达到延缓衰老、滋润皮肤、消皱、养发、美容的目的。修复性胶原蛋白与周围组织的亲和性很好，故而使之具有独特的修复组织的功能。胶原蛋白可以用于皮肤的缺损修复和组织的缺损修复，是很好的医用美容材料。保湿性天然保湿因子是维持皮肤水分十分重要的物质，水解胶原产品中所含的氨基酸与天然保湿因子的成分极其相近。此外，胶原分子外侧有大量的亲水基团羧基、羟基等存在，这使得胶原分子极易和水分子形成氢键，因此，胶原蛋白及多肽拥有相当好的保水、保湿性能。配伍性胶原蛋白可调节和稳定pH值、稳定泡沫、乳化胶体。同时其作为一种功能性成分，在化妆品中能起到减轻各种表面活性剂等刺激性物质对毛发和皮肤的损害的作用。（5）亲和性胶原蛋白对皮肤、头发表面的蛋白分子有很好的亲和力。胶原蛋白分子通过物理吸附与皮肤、头发结合，这些分子可渗入皮肤表皮、头发甚至皮质层以达到营养皮肤的功效。在其他品方面的应用（1）在生物、医学领域的应用胶原蛋白拥有很强的生物活性与生物功能，可以参与细胞迁移、分化及增殖，使骨、腱、软骨、皮肤具有一定的机械强度。胶原蛋白的抗原性较弱的同时生物相容性较好，故可作为生物医药材料中的基础材料。在饲料生产中的应用一种新型饲料蛋白质添加剂——水解胶原蛋白粉，可完全或部分替代进口鱼粉，用于混、配合饲料的生产，具有较好的饲喂效果和很好的营养价值，能带来可观的经济效益。在造纸工业中的应用胶原蛋白在造纸工业中既可以作为原料，也可以作为辅助剂使用。作为原料，胶原纤维分子中含有大量的羟基、氨基、羧基，而在纤维素中也含有大量的羟基和少量羧基。正是因为这两种天然的高分子中含有许多活性基团及活性部位，可通过化学或者物理方法制成复合材料，应用于制造书面革、壁纸、膜塑包装材料、遮光纸、生活用纸、生物胶原包装纸、农副产品包装材料、复合降解材料等。作为辅助剂，胶原蛋白在造纸工业中可以作为黏合剂、增强剂、絮凝剂和表面活性剂等可用于砂纸、砂布等的制造。此外，明胶是照相工业之中制造感光胶片的重要原材料。明胶具有很多优良的性能，在胶片行业中发挥许多作用。迄今为止，还没有无一种材料能够完全取代明胶[20]。2.2.4胶原蛋白的发展趋势人们逐渐认识到胶原蛋白保健功能和护肤功能，尤其是水解胶原蛋白(多肽和寡肽)，具有美容护肤、防治骨质疏松、降血圧、保护胃粘膜和抗氧化等多种生理活性功能，而且胶原蛋白还具备溶解性好等良好的加工特性以及易于人体吸收等优点，具有极高的开发价值。此外，由于疯牛病、口蹄疫等疾病的爆发及宗教信仰等原因，对水产品来源的胶原多肽的研究成为热点，同时此类胶原多肽具有易于溶解、低抗原性、低变性温度、易于提取、成本低等特点，更有应用价值。随着我国水产加工业的发展，越来越多的水产废弃物如鱼皮、鱼鳞等产生。如能从这些废弃物中提取胶原蛋白加以利用，可促进水产加工废弃物的综合利用，减少环境污染，获得更安全的胶原蛋白，开发出各种营养健康食品、化妆品等高附加值的水解胶原系列产品。2.3胶原蛋白的提取方法迄今为止，胶原蛋白的提取方法依据提取介质的不同可分为五类，即酸法、碱法、酶法、盐法以及热水浸提法等[22]，其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白与其他蛋白质进行分离。2.3.1酸法酸法是提取胶原比较常用和有效的方法，即是利用酸在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白，常用的酸有乙酸、盐酸、柠檬酸和乳酸等。其原理是在低离子浓度酸性条件下破坏胶原纤维分子间的盐键和Schiff碱，引起纤维膨胀、溶解，用酸法提取的胶原最大程度的保持了其3股螺旋结构[23]。酸法的缺点是过于繁琐且提取物不纯，这就不利于食品、化妆品工业的加工采用[24]。2.3.2碱法碱法提取即利用碱在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白。碱法常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等。由于它容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。所以，若想保留胶原的3股螺旋结构，此法不可取。碱法存在环境污染，易使蛋白质变性等缺点。迄今为止，有关用碱法提取胶原蛋白的报道相对较少，一般都是配合热水法和酸法一起作用。2.3.3酶法酶法提取是利用蛋白酶使胶原溶解，水解条件温和，反应速率快，提取的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，蛋白纯度高，理化性质稳定，且无环境污染。酶法提取常用的蛋白酶有：胃蛋白酶、胰蛋白酶或者复合酶[25]。由于具有速度快、纯度高、无污染等优点，酶提取法在试验中应用较广泛，但在酶水解下易有苦味肽的产生从而限制了其应用范围。2.3.4盐法盐法提取即利用各种不同的盐在一定外界环境下提取盐溶性胶原蛋白。盐法提取胶原蛋白所用的中性盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原溶解。并且可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理，可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。盐法的缺陷是提取过程中可能降低胶原构象的稳定性。2.3.5热水法热水提取就是原料经过各种前处理后在一定条件下用热水浸提，从而得到水溶性胶原蛋白的方法。热水提取法虽然没有其他杂物的混入，但在高温下蛋白质容易变性，胶原的3股螺旋结构得不到保留，这对提取产物影响颇大[26]。2.4本论文的研究内容及研究意义我国林蛙资源十分丰富，近年来关于中国林蛙的相关研究也越来越多，但人们过于粗放式的大量采集蛤士蟆油的同时，将林蛙其他的宝贵资源作为废弃物丢弃十分可惜，既污染环境，又无法充分发挥林蛙的药用和保健价值。林蛙皮是摘取林蛙油后作为饲料或废弃物的物质，富含多种生物活性物质，具有很高的综合利用价值。本课题立足于中国林蛙资源丰富以及蛙皮中含有大量生物活性物质这一优势，以干燥的林蛙皮为原料，对从林蛙皮中提取胶原蛋白相关提取方法比较进行了研究，并对最佳的提取方法进行了工艺优化。从林蛙皮中提取胶原蛋白方法比较的研究必将拓宽中国林蛙开发和利用的新途径，不仅能丰富我国的药用资源，还将为带动林蛙产业的工业化生产带来贡献和影响。

第三章实验部分3.1材料与设备3.1.1原材料林蛙皮：林蛙晒干，剥下林蛙皮；3.1.2主要仪器（1）TDZ5-WS型离心机，江苏金坛荣华仪器制造有限公司；（2）GYB30-6D型高压均质机，上海东华高压均质机厂；（3）HV-10电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；（4）UV1102型紫外分光光度仪，上海天美科学仪器公司；（5）DK-98-Ⅰ型电子恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；（6）FD-1C型冷冻干燥机，北京德天佑科技有限公司；（7）DHG-914385-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司；（8）RE-52C旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；（9）KQ-250DB型超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；（10）HPX-9082MBE数显电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；3.1.3主要试剂（1）浓盐酸，分析纯，北京试剂厂；（2）浓硫酸，分析纯，北京试剂厂；（3）95%乙醇，分析纯，北京试剂厂；（4）氢氧化钠，分析纯，北京试剂厂；（5）氯胺T，分析纯，北京试剂厂；（6）柠檬酸，分析纯，北京试剂厂；（7）碳酸钠，分析纯，北京试剂厂；（8）冰醋酸，分析纯，北京试剂厂；（9）硝酸，分析纯，沈阳市试剂五厂；（10）对苯二酚，分析纯，沈阳市试剂五厂；（11）氢氧化钾，分析纯，沈阳市试剂五厂；（12）磷酸二氢钾，分析纯，北京试剂厂；（13）高氯酸，分析纯，北京试剂厂；（14）对二甲氨基苯甲醛，分析纯，沈阳市试剂五厂；（15）氯化亚锡，分析纯，北京试剂厂；（16）醋酸钠，分析纯，北京试剂厂；（17）异丙醇，分析纯，沈阳市试剂五厂；（18）正丙醇，分析纯，沈阳市试剂五厂；3.2林蛙皮中提取胶原蛋白试验方法3.2.1胶原蛋白的提取工艺方法本试验研究从林蛙皮中提取胶原蛋白的方法比较，可利用对二甲氨基苯甲醛比色法对各种方法同体积浸提液中胶原含量进行测定，由于羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，故可以根据羟脯氨酸比色结果确认溶液中胶原蛋白含量以比较各种方法提取效果。（1）热水法浸提胶原提取工艺10.00g林蛙皮清洗沥干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗涤沥干200mL蒸馏水在42℃下浸提48h滤掉蛙皮得浸提液（2）酸法浸提胶原提取工艺10.00g林蛙皮清洗沥干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗涤沥干200mL0.1mol/L柠檬酸溶液在37℃下浸提48h滤掉蛙皮得浸提液（3）碱法浸提胶原提取工艺10.00g林蛙皮清洗沥干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗涤沥干200mL0.5mol/LKOH溶液在37℃下浸提48h滤掉蛙皮得浸提液（4）酶法浸提胶原提取工艺10.00g林蛙皮清洗沥干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗涤沥干加30mg胃蛋白酶、200mL0.5mol/L柠檬酸溶液在37℃下浸提48h滤掉蛙皮得浸提液（5）盐法浸提胶原提取工艺10.00g林蛙皮清洗沥干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗涤沥干200mL5％NaCl溶液在37℃下浸提48h滤掉蛙皮得浸提液3.2.2对二甲氨基苯甲醛法测定林蛙皮中胶原蛋白的含量试剂配制（1）0.75％氯化亚锡溶液：将7.5g氯化亚锡溶于500mL水中，再加入500mL6mol/L浓HCl。（2）氯胺T试剂：溶解1.41g氯胺T于100mL如上的缓冲试剂中（现配现用）。（3）对二甲氨基苯甲醛试剂：称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，溶解于35.0mL高氯酸［60%(m/m)］，缓慢加入65.0mL异丙醇（现配现用）。（4）羟脯氨酸标准储备液A，500μg/mL：准确称取羟脯氨酸标准品50.0mg，用少量水溶解于100mL容量瓶中，加入一滴3mol/L硫酸，定容至刻度。该溶液在4℃下能稳定至少一个月。（5）羟脯氨酸标准储备液B，10μg/mL：吸取5mL羟脯氨酸标准储备液A于250容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度。该溶液在4℃下能稳定至少一个月。（6）羟脯氨酸标准工作液：吸取2mL羟脯氨酸标准储备液A及40mL羟脯氨酸标准储备液B于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度（现配现用）。羟脯氨酸标准曲线的绘制 取具塞试管24支，三支一组编号从0至7（每组三支为平行样），第0组作为对照组。从第0组至第7组每支试管依次加入羟脯氨酸标准工作液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL，再按顺序加入3.5mL、3.0mL、2.5mL、2.0mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL、0mL蒸馏水，再向所有具塞试管中加入2.0mL异丙醇及2.0mL氯胺T，摇匀后在室温下放置20min，加入2.0mL显色剂，摇匀后迅速将试管移至60℃的水浴锅中，保温20min，再用流动的自来水冷却试管至少3min，室温下放置30min，最后用紫外可见分光光度计在560nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，建立线性回归方程。胶原蛋白提取的含量测定按工艺流程取五种方法所得浸提液各50mL，置于250mL磨口烧瓶中，加入几粒沸石后，分别向各个烧瓶中加入氯化亚锡溶液100mL，置于水浴锅上加热回流6h以上。将超过6h水浴加热回流的浸提液用滤纸过滤后，用6mol/L热的HCl（约10-20mL）冲洗烧瓶和滤纸，反复冲洗几次，冷却后加水定容至250mL容量瓶中。吸取20mL水解溶液于100mL烧瓶，用10mol/LNaOH调pH至8，过滤于250mL容量瓶，用水冲洗烧杯和滤纸，反复数次，加水定容，混匀备用。吸取上步骤样液1.0mL于10mL具塞比色管中，加入1.5mL蒸馏水，2mL异丙醇，1mL氯胺T，摇匀后放置4min，加入2mL对二甲氨基苯甲醛，加塞混匀，放入60℃水浴加热20min，用冷水冲洗冷却至室温，于560nm处测吸光度。根据上述步骤每种方法取平行试验3组，根据比色测定结果及羟脯氨酸标准曲线计算浸提液中羟脯氨酸含量，由于样品中胶原蛋白含量在等量样品且稀释倍数相同的情况下与羟脯氨酸含量成正比，因此羟脯氨酸含量最高的一组即为胶原蛋白含量最高的一组，该提取方法即为最优方法。（公式1）式中：W—样品中胶原蛋白含量，mg/g；A—标准曲线上相应的羟脯氨酸浓度，μg/mL；11.1—换算系数；m—称取样品质量。3.3结论与讨论3.3.1羟脯氨酸标准曲线的绘制表3-1标准胶原蛋白吸光度值试管编号01234567羟脯氨酸浓度（μg/mL）02468101214标准液（mL）00.51.01.52.02.53.03.5水（mL）3.53.02.52.01.51.00.50异丙醇（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.0氧化剂（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.0显色剂（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.0吸光度值A1(558nm)00.0380.0660.0860.1220.1550.1870.220吸光度值A2(558nm)00.0330.0640.0920.1240.1570.1860.212吸光度值A3(558nm)00.0330.0690.0940.1360.1560.1810.213平均吸光度值A(558nm)00.0350.0660.0910.1250.1560.1850.215图3-1是采用对二甲氨基苯甲醛法测定胶原蛋白的标准曲线，根据羟脯氨酸标品的不同含量通过紫外分光光度计可以得到不同的吸光度从而测定出胶原蛋白含量，该图的测定方程为Y=0.0301x+0.0046，相关系数为R²=0.9991，该方程相关系数较高，线性较好，标准曲线较准确，可以来测定胶原蛋白含量，且误差相对较小。图3-1对二甲氨基苯甲醛法测定胶原蛋白的标准曲线3.3.2胶原蛋白提取的试验结果比较与讨论由于样品中胶原蛋白含量在等量样品且稀释倍数相同的情况下与羟脯氨酸含量成正比，因此羟脯氨酸含量最高的一组即为胶原蛋白含量最高的一组，该方法即为最佳提取方法。根据试验结果对五种方法浸提胶原胶原蛋白的数据进行处理，通过分析表明在同样提取条件下酸法提取羟脯氨酸含量最高，即酸法为从林蛙皮中提取胶原蛋白的最优方法。表3-2五种方法所得浸提液中羟脯氨酸含量的测定提取方法样品质量（g）吸光度值(558nm)平均吸光度值羟脯氨酸含量(μg/mL)热水法10.000.3720.3250.3760.35811.73酸法10.000.5220.5040.5540.52717.34碱法10.000.4020.5160.4240.44714.69酶法10.000.4730.4570.4480.45915.08盐法10.000.1870.2840.2760.2498.123.4最佳提取方法的工艺优化3.4.1酸法提取溶剂的选择酸法提取溶剂的选择方法分别以柠檬酸、盐酸、冰醋酸作为酸法的浸提溶剂，对酸法的最佳提取溶剂进行选择。称取10g蛙皮3组于锥形瓶中，分别加入200mL0.1mol/L柠檬酸、200mL0.1mol/L盐酸、200mL0.1mol/L冰醋酸，在37℃下浸提48h后去除蛙皮得浸提液，再分别取浸提液50mL，按对二甲氨基苯甲醛比色法测胶原蛋白方法进行试验，根据吸光度值对酸法提取溶剂进行选择。酸法提取溶剂的结果比较与讨论实验结果表明（如图3-2），选取柠檬酸、盐酸、冰醋酸分别为提取剂，在相同条件下，用柠檬酸提取所得浸提液中羟脯氨酸含量最高，故本实验采用柠檬酸作为浸提溶剂。图3-2提取溶剂对胶原提取的影响3.4.2单因素试验单因素试验方法按一定的液料比称量经脱色处理后沥干的林蛙皮和一定浓度的柠檬酸在一定温度下浸提若干时间，浸提后将林蛙皮去除得浸提液。根据对二甲氨基苯甲醛比色法测定胶原蛋白含量。取所得浸提液50mL，置于250mL磨口烧瓶中，加入几粒沸石后，分别向各个烧瓶中加入氯化亚锡溶液100mL，置于水浴锅上加热回流6h以上。将超过6h水浴加热回流的浸提液用滤纸过滤后，用6mol/L热的HCl（约10-20mL即可）冲洗烧瓶和滤纸，反复冲洗几次，冷却后加水定容至250mL容量瓶中。吸取20mL水解溶液于100mL烧瓶，用10mol/LNaOH调pH至8，过滤于250mL容量瓶，用水冲洗烧杯和滤纸，反复数次，加水定容，混匀备用。吸取上步骤样液1.0mL于10mL具塞比色管中，加入1.5mL蒸馏水，2mL异丙醇，1mL氯胺T，摇匀后放置4min，加入2mL对二甲氨基苯甲醛，加塞混匀，放入60℃水浴加热20min，用冷水冲洗冷却至室温，于560nm处测吸光度。将吸光度值带入羟脯氨酸标准曲线公式计算得羟脯氨酸含量。所有实验均平行操作三次，结果取平均值。（1）液料比对胶原提取的影响按照上述的提取方法，称取林蛙皮10g置于锥形瓶中，分别按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1称量0.1mol/L的柠檬酸加入锥形瓶中，并于37℃下浸提36h后去除蛙皮得浸提液，再分别取浸提液50mL，按对二甲氨基苯甲醛比色法测胶原蛋白方法进行试验，根据吸光度值计算浸提液中羟脯氨酸含量，确定较适宜的液料比。（2）柠檬酸溶液浓度对胶原提取的影响按照上述的提取方法，称取林蛙皮10g置于锥形瓶中，分别取柠檬酸溶液浓度为0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L，以液料比20∶1称量柠檬酸200mL加入锥形瓶中，并于37℃下浸提36h后去除蛙皮得浸提液，再分别取浸提液50mL，按对二甲氨基苯甲醛比色法测胶原蛋白方法进行试验，根据吸光度值计算浸提液中羟脯氨酸含量，确定较适宜的柠檬酸溶液浓度。（3）提取时间对胶原提取的影响按照上述的提取方法，称取林蛙皮10g置于锥形瓶中，以液料比20∶1称量柠檬酸200mL加入锥形瓶中，并于37℃下分别浸提24h、36h、48h、60h、72h后去除蛙皮得浸提液，再分别取浸提液50mL，按对二甲氨基苯甲醛比色法测胶原蛋白方法进行试验，根据吸光度值计算浸提液中羟脯氨酸含量，确定较适宜的提取时间。（4）提取温度对胶原提取的影响按照上述的提取方法，称取林蛙皮10g置于锥形瓶中，以液料比20∶1称量柠檬酸200mL加入锥形瓶中，并于12℃、25℃、32℃、37℃、40℃下分别浸提36h后去除蛙皮得浸提液，再分别取浸提液50mL，按对二甲氨基苯甲醛比色法测胶原蛋白方法进行试验，根据吸光度值计算浸提液中羟脯氨酸含量，确定较适宜的提取温度。单因素实验结果比较与讨论（1）液料比对胶原提取的影响实验结果表明（如图3-3），当液料比超过20∶1时浸提液中羟脯氨酸含量在逐渐降低。可能是此时柠檬酸溶液对胶原的溶解已经趋于饱和，过多的柠檬酸用量不能有效增加提取率，反而因为柠檬酸用量的增多降低了胶原蛋白在溶剂中的浓度，使浸提液羟脯氨酸含量有所下降。图3-3液料比对胶原提取的影响（2）柠檬酸溶液浓度对胶原提取的影响实验结果表明（如图3-4），随着柠檬酸溶液浓度的提高，浸提液中羟脯氨酸含量逐渐升高，原因可能是随着提取剂浓度的增加，胶原蛋白的溶解度增加；但当柠檬酸浓度超过0.1mol/L时，浸提液中羟脯氨酸含量逐渐降低，可能是此时柠檬酸溶液对胶原的溶解已经趋于饱和，过高的柠檬酸浓度不能有效增加提取率，反而因为柠檬酸浓度的增多降低了胶原蛋白在溶剂中的浓度，使浸提液羟脯氨酸含量有所下降。图3-4柠檬酸浓度对胶原提取的影响（3）提取时间对胶原提取的影响实验结果表明（如图3-5），随着浸提时间的增加，浸提液中羟脯氨酸含量逐渐增加。但当提取时间超过48h以后，浸提液出现变味酸败，蛙皮上有部分被霉菌感染，因此60h及72h两组试验均被直接否定。图3-5提取时间对胶原提取的影响（4）提取温度对胶原提取的影响实验结果表明（如图3-6），提取温度对提取胶原有一定影响。在37℃之前，浸提液中羟脯氨酸含量随温度上升而增高，但当温度超过37℃时，羟脯氨酸含量反而下降，这可能与胶原蛋白的溶解度有关。可能是低温时提高温度使分子动能增加，提高了溶质扩散的速率，导致胶原溶解度的增加；但当温度高于37℃时，由于反应是放热反应，溶解度随温度升高而减少。图3-6提取温度对胶原提取的影响3.4.3正交试验正交试验方法在单因素试验的基础上，选取四个主要影响因素：液料比、柠檬酸浓度、提取时间、提取温度，进行L9(34)正交试验，因素水平见表3-3，以浸提液中羟脯氨酸含量为指标，确定最佳提取工艺。表3-3正交试验表水平因素A液料比（mL/g）B提取时间（h）C柠檬酸浓度（mol/L）D提取温度（℃）115240.132220360.237325480.440正交试验结果比较与讨论在单因素试验的基础上按表3-3进行了正交试验，试验结果如表表3-4：表3-4正交试验结果表试验号因素羟脯氨酸含量（μg/mL）ABCD液料比（mL/g）提取时间（h）柠檬酸浓度（mol/L）提取温度（℃）111114.882122214.84313337.054212311.43522314.596231217.44731328.75832139.90933215.13均值18.928.4410.744.86均值211.159.7810.4713.68均值37.929.886.809.46R3.231.443.948.81较优水平A2B3C1D2逐次因数D>C>A>B经数据分析可知，对提取率影响最大试验因素的是提取温度，其次是柠檬酸浓度、液料比、提取时间。最佳的提取工艺为：柠檬酸浓度0.1mol/L，提取温度37℃，提取时间48h，液料比为20:1。

第四章结论与展望4.1结论（1）本论文对从林蛙皮中胶原蛋白的提取方法进行了比较，分别利用热水法、酸法、碱法、酶法及盐法对林蛙皮中胶原蛋白进行了提取，通过使用等量林蛙皮，等量浸提液，并取等量部分浸提液利用对二甲氨基苯甲醛法对浸提液中胶原含量进行了测定，经试验表明酸法为最佳提取方法。（2）在得出酸法为最佳提取方法后，对试验工艺进行优化，在单因素试验的基础上，经正交试验确定了酸法提取的最佳工艺条件：柠檬酸浓度0.1mol/L，提取温度37℃，提取时间48h，液料比为20:1。4.2展望中国林蛙资源十分丰富，且尚有很多附加价值有待进一步的开发利用。林蛙皮是摘取林蛙油后作为饲料或废弃物的物质，富含多种生物活性物质，具有很高的综合利用价值。充分利用林蛙皮资源，既可以保护环境，也可以有效发挥中国林蛙的药用、保健价值。对从林蛙皮中提取胶原蛋白方法比较的研究必将拓宽中国林蛙开发和利用的新途径，不仅能丰富我国的药用资源，还对带动林蛙及胶原蛋白产业的工业化生产有着重要的影响和意义。

致谢本文是在导师邱芳萍老师悉心指导和大力支持下完成的。在试验的过程中，邱老师以其严谨求实的科学态度、实事求是的科研作风深深地感染和激励着我，她渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪，让我终生受用。邱老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此向邱老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。其次，我要感谢王志兵老师在论文试验和撰写过程中的耐心指导，这期间王老师为本毕业设计提出了许多宝贵的意见和建议。王老师不仅是我们求学路上的良师，更是我们生活中的益友，在此对王老师四年来的帮助表示深深的感谢。再次，在整个试验的设计和实施过程中，我得到了王长周学长、季晓峰学长、杜琳学姐、刑燕学姐和纪可学姐的无私帮助，还有与我一同完成论文的李兵、万茉、王天龙同学的关心和支持，使我得以顺利完成论文。没有他们的帮助和支持，我是没有办法顺利完成我的学位论文的，愿同窗之间的友谊长存。最后，向大学本科四年里对我有过帮助的所有老师和同学们表达最衷心的感谢！感谢所有老师对我的辛勤培养和帮助！感谢所有同学对我的关心和支持！是你们让我的大学生活充满阳光与温暖，让我人生的记忆中多了如此幸福的一笔。祝各位老师身体健康，工作顺利，科研事业上取得更大的成就，祝各位同学能够通过努力的奋斗实现自己的理想。谢谢！

参考文献[1]李东风，陈伟庭.中国林蛙研究进展[J].辽宁师范大学学报(自然科学版)，2005，28（1）：92～94.[2]胡晓丹，李波.哈士蟆的价值及利用[J].中国食物与营养，2001（2）：27～28.[3]葛蕾，李志西，司翔宇，等.超声波提取苹果渣多酚工艺研究[J].食品研究与开发，2005，26（1）：79～81.[4]王长周，邱芳萍，房天琪，等.林蛙皮胶原蛋白肽的制备工艺[J].食品工业科技，2012，33（7）：309～311.[5]崔岩，蒋超，崔春月.中国林蛙产品开发及利用现状[J].林业实用技术，2006（12）：33.[6]李妍妍，郑卫星，王日昕，等.林蛙营养成分的多元分析[J].食品科学，2007，28（12）：472～-476.[7]蒋挺大，张春萍.胶原蛋白[M].北京：化学工业出版社，2001：1～60.[8]万春燕，王英华，邬元娟，等.胶原蛋白在食品中的应用现状及其发展前景[J].中国食品与营养，2008（9）：24～26.[9]MendisE，RajapakseN，KimSK．Antioxidantprop