(用)丙肝实验室检测20130619幻灯片

丙型肝炎实验室

检测策略河北省疾病预防控制中心性病艾滋病防治所赵翠英病原学病原—丙型肝炎病毒（HCV）丙型肝炎病毒（HCV）于1989年被正式命名，在此之前被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。1991年被归为黄病毒科（Flaviviridae）虽然丙型肝炎作为疾病早已被发现，但直到2005年HCV体外细胞培养才获得成功。这对进一步认识HCV结构与功能、深入研究HCV的发病机制、研究和开发抗HCV药物和疫苗具有重要意义。发现与命名

HCV的特性黄病毒科有包膜单股正链RNA(9.6kb)3000氨基酸组成的多聚蛋白RNA聚合酶缺乏校正功能

－准种（quasi-S）每日复制量：10兆(1012)病毒颗粒病毒的基因结构

HCV分为6个主要基因型及不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型（如1a、2b、3c等）

基因型丙型肝炎病毒基因分型1a,1b

2a,2b,3a1a,1b

2a,2b,2c,3a45a1b1b,61b,3a1b,3a3b4ClinicalMicrobiologyReviews,2000,13(2)223-235HCV1b型是我国主要流行型1a,1b,2b,3a2aHCV具有显著异源性和高度可变性。在HCV的编码基因中，C区最保守、非结构（NS）区次之，编码囊膜蛋白E2/NS1可变性最高称为高可变区，为HCV基因组中变异最大的部位。变异性

HCV、HIV的比较HCVHIV病毒类型RNA病毒（黄病毒）RNA病毒（逆转录病毒）血液传播血液水平传播为主,输血制品、静脉吸毒、不洁注射、性乱、纹身美容等血液水平传播为主性乱、输血制品、静脉吸毒、不洁注射、母婴传播少见可见抗体无保护作用无保护作用预防目前无疫苗目前无疫苗HBV和HCV特点比较

HBV双链DNA病毒嗜肝DNA病毒科4个开放读框

高病毒血症高感染性

与宿主基因整合无细胞毒性HCV单链RNA病毒黄病毒科1个开放读框

低病毒血症低感染性

不与宿主基因整合细胞毒性(?)HCV感染的自然史

HCV感染的自然史HCV急性感染—痊愈的血清学特征HCV急性感染—慢性感染的血清学特征HCV实验室检测技术规范第一章丙型肝炎病毒第二章丙型肝炎病毒抗体检测第三章丙型肝炎病毒抗原检测第四章丙型肝炎病毒核酸检测第五章丙型肝炎病毒基因检测第六章丙型肝炎病毒细胞培养第七章实验样品的采集、保存、运输第八章丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证第九章实验室生物安全抗体检测抗原检测核酸检测基因检测

丙型肝炎病毒常用检测方法

丙型肝炎病毒抗体检测抗体筛查试验：酶联免疫、胶体金法、化学发光、免疫荧光试验抗体补充试验

:重组免疫印迹法（RIBA)

使用抗-HCV试剂，必须是经过国家食品药品监督管理局注册，在有效期内的试剂。应根据目的和试剂使用范围，选择抗体检测试剂。抗体检测试剂抗体检测的意义在临床上，大多数患者有肝脏疾病的临床表现，筛查检测的敏感性和特异性均较高，抗-HCV的假阳性结果较为少见。在HCV感染的低流行人群中（如无偿献血员、现役或退役军人、普通人群、卫生保健从业人员、到性传播疾病门诊就诊的人员），假阳性率较高，阳性预期值较低。丙型肝炎病毒核酸检测HCVRNA定性检测：血液筛查COBASAmpliScreenHCV2.0（PCR技术），VersantHCVRNA定性检测（TMA技术）HCVRNA定量检测：判断抗病毒治疗疗效深圳匹基、上海科华、深圳达安及华美等实时荧光定量PCR、b-DNA技术丙型肝炎病毒基因型检测试剂：TrugeneHCV分型试剂盒，Inno-LiPAHCV基因分型2.0试剂盒等技术原理：限制性片段长度多态性（RFLP）、测序法及反相线性探针杂交法（reversehybridizationlineprobeassay，LiPA）等检测意义：有助于决定抗病毒疗程和药物剂量，减少浪费，减轻药物不良反应，提高患者依从性丙型肝炎病毒检测策略诊断：确定个体HCV感染状况。包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等；血液筛查：防止输血传播HCV。包括献血/浆员筛查和原料血浆筛查；

监测：了解人群HCV感染率及变化趋势。包括各类高危人群、重点人群和一般人群。

筛查试剂样品阴性反应初筛试验阳性反应复检试验均阴性反应一阴一阳均阳性反应补充试验原有试剂双孔或原有试剂加另一种不同原理（或厂家）试剂报告阴性图1临床诊断筛查检测流程复检阳性样品阳性反应免疫印迹试验阴性反应报告阴性图2直接进行补充试验检测流程不确定核酸检测阳性反应阴性反应报告不确定报告阳性复检阳性样品不确定免疫印迹试验阴性反应报告阴性图3“根据试剂S/CO比值”的确证检测流程阳性反应报告阳性报告不确定根据S/CO值判断高S/CO值低S/CO值“根据其S/CO比值”的方案进行确证试验对于高S/CO比值（当S/CO比值≥特定的阈值时，其确证试验结果阳性的预测值≥95％）的筛查试验阳性标本，可报告为“抗-HCV阳性”，无需再做确证试验；对于低S/CO比值（其S/CO比值<特定的阈值）的筛查试验阳性标本，应进一步做确证试验，最好是RIBA。如针对AbbottHCVEIA2.0，当S/CO≥3.8时可报告抗HCV阳性，对于抗体S/CO低于3.8（或低于试剂制造商所提供的判定标准），需进行免疫印迹试验（RIBA）确认。应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标本一并送检。

HIV HCV 诊断试验筛查试验 EIA，RT， PA EIA，RT

化学发光 化学发光补充试验 WB

RIBA，RNA

（抗原）替代策略 S/CO6以上 S/CO3.8以上治疗相关检测 CD4，RNA RNA，亚型美国亚特兰大Emory大学病理和医学实验室的Dr.Nolte对HCV抗体筛查阳性的样本进行RIBA确认实验：观察了1000例，75例ELISA阳性，其中：S/CO比值>3.865例，RIBA阳性64例（占98.5%）S/CO比值<3.810例，RIBA阳性3例（30%）（Dr.Nolte的实验室目前已经采用了CDC的新导则，现在仅对筛查试验S/CO比值<

3.8的样本做RIBA补充实验。这样实验室即节约了大量资金，又使抗体检验结果更加可靠。）

美国CDC报告的HCV-EIA初筛试验与RIBA确证试验的符合率 人群感染率总样本量 S/CO EIA+（%） RIBA（%）

- +/- + 2% 24012 total 689 26.9 7.3 65.9 1-3.8 231（33.5） 78.8 16.9 4.3 >3.8 458（66.5） 0.7 2.4 96.9 9.5% 2936 total 351 9.7 7.3 83.0 1-3.8 45（12.8） 64.4 33.3 2.2 >3.8 306（87.2） 1.6 3.4 95 24.9% 498 total 124 1.6 4 94.4 1-3.8 3（2.4） 66.7 33.3 0 >3.8 121（97.6） 0 3.3 96.7 血液筛查相关的检测策略初筛试验献血/浆员临床体检合格后抽血检验，用抗体筛查试剂进行初筛。结果呈阳性反应，报告“抗-HCV阳性待确证”，献血/浆员暂停献血如果进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；结果呈阴性反应，报告“抗-HCV初筛阴性”，献血/浆员献血，进入复检试验。血液筛查相关的检测策略复检试验对初筛呈阴性反应的样品用另一种抗体筛查试剂重复检测。如重复检测呈阳性反应，则报告“抗-HCV阳性待确证”，血液报废，如果进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；如重复检测呈阴性反应，报告“抗-HCV复检阴性”，血液供应临床。对初筛呈阴性反应的样品用集合NAT(PoolingNAT)（核酸扩增检测）重复检测。如重复检测呈阳性反应，做单人份NAT检测，阳性结果报告“HCV阳性”，血液报废，如果进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；如重复检测呈阴性反应，报告“HCV复检阴性”，血液供应临床。另一种抗体筛查试剂或NAT血液筛查相关的检测策略样品阳性反应初筛试验阴性反应复检试验阳性反应阴性反应报告阳性待确证抗体筛查试剂报告阴性图4血液筛查检测流程疫情监测相关的检测策略

样品阴性反应初筛试验阳性反应复检试验阴性反应阳性反应报告阴性筛查试剂（高敏感性）报告阳性筛查试剂（高特异性）图5HCV感染疫情报告检测流程根据补充试验结果报告抗-HCV检测结果的解释

抗-HCV筛查结果补充试验结果报告解释筛查试验阴性不需检测抗-HCV阴性未感染HCV，除非怀疑最近被感染或存在其它证据提示感染HCV。筛查试验阳性，且S/CO比值高未做抗-HCV阳性可能提示既往感染或现在感染了HCV；未做血清学补充试验。高S/CO比值的样品常被确证为阳性（≥95％），但尚有<5％的样品可能为假阳性；可在患者要求下进行特异性更好的补充试验。筛查试验阳性免疫印迹阳性抗-HCV阳性提示既往感染或现在感染HCV。筛查试验阳性免疫印迹阴性抗-HCV阴性未感染HCV，除非怀疑最近被感染或存在其它证据提示感染HCV。筛查试验阳性免疫印迹可疑抗-HCV可疑不能确定抗-HCV结果及HCV感染状态；应再采集另一份样品（>1个月）重测抗-HCV或HCVRNA。筛查试验阳性NAT阳性抗-HCV阳性HCVRNA阳性提示活动性HCV感染。筛查试验阳性NAT阴性免疫印迹阳性抗-HCV阳性HCVRNA阴性存在抗-HCV，提示既往感染或现在感染HCV；由于某些HCV慢性感染病人的HCVRNA间隙阳性，因此一次HCVRNA阴性结果不能排除活动性感染。筛查试验阳性NAT阴性RIBA阴性抗-HCV阴性HCVRNA阴性未感染HCV。筛查试验阳性NAT阴性RIBA可疑抗-HCV可疑HCVRNA阴性抗-HCV筛查结果可能是假阳性，在这种情况下，提示未感染HCV。HIV/HCV共感染Asia26%Europe33%Spain50%UnitedStates30%Shermanetal.AntiviralTher.2000;5(Suppl1):64-65.Lauer,Walker.NEnglJMed.2001;345:41-45.Sorianoetal.XIIIthIAS;July9-14,2000;Durban,SouthAfrica.AbstractThOrB655.WorldwidePrevalenceofHCVinPatientswithHIVInfectionHIV/HCV共感染美国HIV感染者共感染HCV的比例平均为33%，根据感染途径不同有所区别，IDU人群60-90%，MSM人群10%以下（最近有所增加）。另一报告：HCV感染者中HIV感染率10%，HIV感染者中，约25%HCV阳性。HIV/HCV共感染状况估计（IrenaMaier,Georgey.Wu.WorldJGastroenterology2002;8(4)577-579）统计 HCV HIV

美国感染人数 4百万 1百万全球感染人数 6千至一亿八千万 四千五百万初发传播 血液 性治愈 可以（40%） 不可 每天复制 1012-13

109-10变异率 10-3-10-4 10-3-10-4 HIV对HCV的影响许多研究证明，HIV感染可以对HCV感染的各个阶段产生影响:例如出现更高的HCV载量（机制不清），更多的终末期肝脏疾病，HCV临床进展更快，对抗病毒治疗的影响,抗HIV药物会使肝脏酶增加，HCV载量增加，尤其是CD4细胞数低的病人；也有研究认为HIV感染会使肝硬化增加，加速疾病进程总之，对共感染的病人，HAART治疗时应特别注意肝脏疾病，线粒体毒性，过敏反应的发生

发展为肝硬化感染后10年发生的平均时间 肝硬化的比例 HCV+ 23.2年 2.6% HCV+/HIV+ 6.9年 14.9% P <0.001 <0.01 （DavidL.Thomas.AdvStudMed.2005;5(4c):s352-355）我国不同传播途径感染HIV+者合并HCV感染率有偿供血感染HIV者中：合并HCV感染率为30.5%~86.3%。静脉吸毒感染HIV者中：合并HCV感染率为24.3%~96.7%性接触感染HIV者中：合并HCV感染率为2.1%~5.7%我国IDUs人群中HCV、HBV、HIV重叠感染

地点研究例数HCV感染率HCV/HBV感染率HIV/HCV感染率HIV/HCV/HBV感染率云南昆明12576.88.8--广西48582.99.616.6-湖南10632.110.4--广东中山31766.213.92.20.6广西南宁14879.718.24.71.4广西柳州20889.421.6--湖南772-24.3--新疆20692.724.823.318.5四川37074.3-14.4-河北省HIV-1感染者中HCV和HBV合并感染状况调查[中国艾滋病性病2012,18（8）]结果:147例HIV-1感染者中HCV感染率为17.7%（26/147），HBV感染率为15.0%(22/147)，HCV/HBV混合感染率为3.4%(5/147)。在HIV-1感染者中丙型肝炎的感染率，在不同传播途径间差异有统计学意义（P<0.001），在注射吸毒者中为100%（6/6），血液途径传播者中为73.3%（11/15），性传播者中为6.3%（7/111）HIV/HCV混合感染对疾病进程影响的研究

国际上大量的研究表明HIV加剧HCV的疾病进展。而HCV尽管对艾滋病的疾病进展没有发生明显的影响，但是HCV的感染增加的HIV抗病毒治疗药物的肝脏毒性。HCV感染对HIV的影响HCV感染可使HIV感染到AIDS的进程加快；HCV感染可损伤HAART治疗后的免疫重建；HCV感染可使HARRT治疗的肝脏毒性加重；HIV/HCV混合感染后HIV母婴传播率为26%，单纯HIV感染为16%。HIV感染对HCV的影响HIV感染可加速HCV的病程进展（更易进展为肝硬化、肝癌和死亡）。HIV感染可妨碍急性感染者HCVRNA的清除，增加慢性感染的危险性。HIV/HCV混合感染后HCV母婴传播率为15-36%，HCV单独感染为0-5%HIV感染增加HCV抗体检测的假阴性率由于免疫抑制，造成HCV抗体产生缺乏、HCV抗体滴度低下、两种病毒间可能存在相互影响、抗HCV血清转化为阴性状态，会产生假阴性（约19.5%*）HIV感染者应进行HCVRNA的检测以明确HCV的感染。RggrenRetal.,8thCROI2001ShermanKEetal.,ClinInfectDis2002HIV感染者中HCV的检测策略：1、由于HIV/HCV共感染率很高，美国卫生部建议所有HIV感染者检测HCV。2、由于HIV