调节SREBP-2细胞内转运增强自噬流对脂质代谢和内质网应激的影响

调节 细胞内转运增强自噬流对脂质代谢和内质网应激的影响目的探讨通过抑制 或和 蛋白生物活性或沉默两者基因表达,是否影响细胞内转运过程、自噬相关基因的表达以及细胞自噬流动态过程。方法用.不同浓度特异性抑制剂表达,是否影响细胞内转运过程、自噬相关基因的表达以及细胞自噬流动态过程。方法用.不同浓度特异性抑制剂特异性抑制剂、0、0、0、0n）干预人肝细胞细7胞0和2细胞干预不同时间采用方法检测自噬相关采用方法检测自噬相关基因和基因表达水平用双标质粒转染细7基因和基因表达水平用双标质粒转染细7胞0和2细胞后加入）或/和自噬溶酶体抑制剂氯喹干预采用方法检测 蛋白表达并且在激光共干预采用方法检测 蛋白表达并且在激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬流的变化情况。2.用转染小鼠肝细胞-细1胞2,采用转染小鼠肝细胞-细1胞2,采用方法检测自噬相关基因和 、 、基因表达水平。结特异性抑制剂或特异性抑制剂促进细胞自噬基因的表达呈时间和剂量依赖关系。与对照组相比 、表达无显著统计学意义但随着干预浓度增加、时间延长前体形式蛋白表达增加活化片段蛋白表达降低。检测显示和延长前体形式蛋白表达增加活化片段蛋白表达降低。检测显示和9共同干预组或和 共同干预组 蛋白比例显著增加激光共聚焦显微镜观察发现与对照组相比 或者单独干预组细胞中的红色斑点显著增加而与 或者单独干预组相比与共同干预组黄色斑点明显增加提示或都能增强细胞自噬流。抑制1基因表达后白噬相关基因、和 表达水平明显升高但是水平无明显变化 及3 I蛋白表达增加 蛋白表达减低。结论抑制或蛋白功能活性影响 蛋白表达水平可以促进自噬相关基因的表达促进细胞自噬流。抑制或基因的表达也可以影响 蛋白表达水平促进自噬相关基因的表达。目的探讨 患者肝脏组织标本、棕榈酸诱导的脂肪变性肝细胞和高脂饮食喂养的小鼠肝脏组织中蛋白表达水平和自噬活性水平变化情况以及在细胞和小鼠脂肪变模型中调节 的细胞内转运对脂质自噬的影响及意义。方法 例患者肝脏组织和例正常肝脏组织用于检测蛋白前体形式 、入核活化片段端和蛋白表达水平以及自噬相关蛋白 和溶酶体相关膜蛋白的表达水平肝组织石蜡包埋切片用于免疫荧光双标染色观察和 共定位情况。用棕榈酸干预 细胞和 细胞构建脂肪变细胞模型再用特异性抑制剂 或和特异性抑制剂十预细胞米用 方法检测 、 、、自噬相关蛋白、、 、 及自噬体底物蛋白死骨片蛋的蛋白表达情况脂肪变性肝细胞转染双标质粒再用 或和或干预在共聚焦显微镜观察细胞内红、绿、黄色斑点;利用透射电子显微镜观察处理后的细胞内脂滴、自噬体、自噬溶酶体情况用油红染色观察细胞内脂滴用 异丙醇溶解这些结合在细胞脂滴上的油红用吸光度定量同时用酶法定量细胞裂解液中的甘油三脂和胆固醇 含量。在高脂饲料 喂养周的 小鼠中通过小鼠尾静脉注射1 包装的慢病毒天后处死各组小鼠。用方法检测 和 表达水平用 方法检测 、 、 - 、 、 、和 蛋白表达水平用免疫荧光双标染色共聚焦法检测 和细胞内定位以及 和 定位及表达利用透射电子显微镜观察各组小鼠肝脏细胞中脂滴、自噬体、自噬溶酶体情况用油红染色观察细胞内脂滴同时用酶法定量各组小鼠血清中的、、谷草转氨酶 和谷丙转氨酶的含量。结果与对照组相比的组肝脏组织中的表达增加且 表达增多II I表达增加同时表达降低免疫荧光双标染色显示绿色斑点数显著增加红色斑点数轻微降低。在干预的 细胞和细胞中 、 表达增加而 表达差异无统计学意义 II I表达增加也轻微增加 表达也增加 表达降低。在干

预的基础上用 和或干预的基础上用 和或干9预2细4胞2,发现表达降低而 增加 II I、 、 及表达都增加同时 表达降低激光共聚焦显微镜观察发现 细胞和细胞在干预后与干预后一致仅有绿色和黄色斑点增加而加用和或 干预后发现细胞中黄色斑点和红色斑点都增加,尤其是不能重合的红色斑点显著增加;透射电子显微镜观察发现在干预后在大量脂滴沉积时自噬体囊泡也形成而加用和或 干预后双层膜的自噬体及单明显升高而加和或少、含量明显降低。水平分别降低了和组明显升高而加和或少、含量明显降低。水平分别降低了和组干9预发后4,发细胞内脂滴沉积明显减结果显示沉默组 和结果显示 阴性对照表达增加而沉默组表达降低 积累共聚焦显微镜下也可观察到在组细胞核内大量 溶解蛋白积累而沉默组细胞核内 表达减少;相对于正常饲料喂养组沉默组少;相对于正常饲料喂养组沉默组III、G 蛋白表达增加相对于组 蛋白表达降低 蛋白表达增加免疫荧光共聚焦也显示组表现为绿色荧光斑点增加而沉默组 红色荧光斑点明显增加电镜也表明相对于组 组自噬体数量增加沉默组自噬体和自噬溶

酶体数量增多且细胞内脂滴数量减少、脂滴体积减小油红染色显示组肝细胞大量脂滴沉积沉默组脂滴沉积显著减少。相对于组沉默组血清、及 含量显著降低含量轻微降低。结论在 患者肝脏组织、棕榈酸诱导的脂肪变性肝细胞和高脂饲料喂养的小鼠肝脏组织中都存在 异常活化及自噬流受损的情况。在处理的脂肪变细胞模型中用和或干预细胞抑制 活化裂解可以增强肝细胞自噬流促进脂质自噬降解脂质减少脂质含量。在小鼠模型中和沉默小鼠肝脏中 和基因表达同样可以抑制 活化裂解,增强肝细胞自噬流,促进脂质自噬,降解脂质,减少脂质含量。目的探讨在体内外脂肪变模型中调节 细胞内转运恢复细胞自噬流对内质网应激的影响及意义。方法用 特异性抑制剂或和 特异性抑制剂 或自噬溶酶体抑制剂干预游离脂肪酸棕榈酸诱导的脂肪变 细胞和细胞采用TOC\o"1-5"\h\z方法检测内质网的分子标记物 、 、a及a蛋白表达情况并用 进行细胞核染色在荧光显微镜下观察细胞核的形态学改变,并对每组凋亡的细胞进行计数。2在在高脂饲料喂养周的 小鼠中通过小鼠尾静脉注射 和包装的慢病毒天后处死各组小鼠。用 方法检测内质网的分子标记物 、 、a及 a蛋白表达情况。结果在体外脂肪变性细胞模型中用和或干9干9预白后4a蛋白表达显著降低。而在 和或 干预的基础上加干预后 和 a蛋白表达升高。 染色显示与干