八种肝纤维化造模方式PPT

肝纤维化造模目录造模类型研究背景123致谢

肝纤维化是肝脏对化学刺激或持续损伤作出的以细胞外基质（ECM)过度累积为主要特点的一种常见的免疫应答。该病涉及到诸多复杂的致病因素。比如：病毒感染，酒精、药物或化学毒性等因素所致ECM生成分泌量和消耗吸收量相对失衡，使ECM过度沉积并可能导致发展成肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等重症肝脏疾病。其中涉及的细胞功能和分子机制也很复杂。选择适当的肝纤维化动物模型是深入研究肝纤维化发病机制的重要基础,也是筛选防治肝纤维化药物的有效手段。

1.研究背景CCl4法是最早且被最广泛应用于肝纤维化模型建立的一种经典造模方法。其作用机制为:CCl4是氯化烷烃类化合物,可以选择性损害肝、肾功能。CCl4进入动物体内后,可直接进入肝细胞,溶解肝细胞膜上的脂质成分，致肝细胞损伤、变性、坏死;也可以经肝微粒体内氧化酶的激活而产生三氯化碳(－CCl3)，与肝细胞内大分子发生共价结合，破坏肝细胞功能；同时使静止的贮脂细胞活化,释放Ⅳ型胶原酶,降解Ⅳ型胶原,合成分泌Ⅰ型胶原,促使肝纤维化。2.造模类型CCl4诱导肝纤维化模型CCl4法造模途径多样，有单纯性皮下注射、灌胃、腹腔注射及在此基础上加以不同喂饲手段的复合法。造模时间因给药途径、剂量及饲喂方法的不同而异，一般为6～16周不等。1.皮下多点注射:给大鼠皮下注射60%CCl4植物油溶液0.3mL/100g,2次/周,发现大鼠肝脏炎症和纤维组织增生程度随实验时间延长逐渐加重，20周后正常肝小叶结构消失，假小叶形成。2.灌胃法:用60%CCl4植物油液给大鼠灌胃。首次0.5mL/100g，以后0.2mL/100g，2次/周，共6周，同时给与5%乙醇。见广泛肝细胞变性坏死，纤维组织明显增生，形成假小叶。3.腹腔注射:40%CCl4橄榄油溶液，首次腹腔注射3mL/kg，其余2mL/kg，每周注射2次。8周后部分标本肝脏假小叶形成，达到早期肝硬化。目前研究表明CCl4腹腔注射造模优于其他方法。4.复合法：在上述方法基础上配以高脂低蛋白、高胆固醇低胆碱食物或以酒精灌胃的造模方法即为复合法。

CCl4诱导的肝纤维化模型优点:①在病理生理学方面与人类肝纤维化和肝硬化的某些方面相类似,如二者均有肝细胞坏死后的再生,肝硬化晚期纤维的浸润几乎不可逆;②肝纤维化病程进展和病变特征稳定,重复性好;③具有造模简便、费用低廉、耗时短。此方法可应用于体内研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性以及抗纤维化药物的筛选。缺点:①不同动物经相同剂量CCl4处理后出现的肝纤维化程度个体差异较大,因而组织学和病理生理学表现也不一致,加大了判断的难度;②CCl4毒性剧烈,若剂量和给药方式掌握不当,模型死亡率很高。二甲基硝胺（DMN）具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性,它在体内通过肝微粒体主要代谢为乙醛。乙醛是一种高反应活性化学物，可与核酸、蛋白质等重要的生命物质结合并使其发生甲基化导致肝细胞坏死，刺激合成细胞外基质，形成肝纤维化。造模方法:通过给实验动物腹腔注射DMN(5～10mg/kg体质量)第1周连续3次,第2、3、4周各1次,第6、7周各连续2次,共8周可以诱导大鼠肝纤维化动物模型二甲基硝胺诱导肝纤维化模型与CCl4造模相比,该模型中肝细胞无脂肪变性、肝纤维化形成相对稳定,但DMN易引起肝细胞坏死出血，引起肝功能衰竭，从而导致复制模型过度。DMN所致肝内出血性病变与CCl4所致肝内凝固性病变不同,其肝损伤比较严重。因此在评价药物对伴有凝血障碍、纤溶亢进的慢性肝病致纤维化的防治效果时,采用DMN肝纤维化模型较为合适。此模型的缺陷是难以全面反应人肝纤维化的发病机制。作用机制：通过氧化产生活性化合物与肝内物质相结合，延长细胞有丝分裂，从而影响肝内酶代谢过程，致使肝细胞结节、坏死。此外，TAA在肝内代谢为硫氧化物与肝大分子物质结合，引起肝损伤，同时还可激活磷脂酶A2，引起肝细胞膜破坏，导致肝坏死，诱发肝纤维化。TAA法常用的方法是皮下注射，0.03%TAA以200mg/kg的剂量，2次/周，4周后出现部分肝细胞坏死，胶原增生明显，至第9周假小叶出现。另有实验研究以腹腔注射法制备，以0.03%TAA给体重(150±10)g的大鼠注射1mL，2次/周，共8周，模型具有明显肝纤维化该模型可研究肝硬化向肝癌转化的机理。但由于是致癌物，试验中慎用。硫代乙酰胺(TAA)诱导肝纤维化模型肝脏是酒精代谢的主要场所，进入肝脏的酒精转化为乙醛。乙醛及其转化物乙酸通过增加肝细胞膜的通透性、增加肝细胞细胞膜的磷脂、脂质过氧化产物及电荷量、激活线粒体中caspase-9和-3等多种途径损伤肝脏的结构及功能从而导致持续炎症反应。同时，使肝内脂肪氧化减弱，长时间形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。造模方法：40%乙醇按照大鼠体重2mL/100g灌胃,每周3次,持续29周,可复制酒精性肝纤维化模型此模型制作方法简单易行,肝纤维化病变率高,可用于酒精性肝纤维化发病机理、以及筛选有效抗酒精性肝纤维化药物的研究。乙醇诱导肝纤维化模型刀豆素蛋白A(ConcanavalinA,ConA)是一种植物血凝素,具有强力的促有丝分裂作用,可激活T细胞分泌多种细胞因子,引起特异性的肝损伤,肝实质可见大量淋巴细胞浸润,主要以CD4+T淋巴细胞为主。利用ConA造模,病理观察可见肝小叶结构紊乱,肝细胞明显减少,可见点状、片状和局灶性坏死,肝间质淋巴细胞明显增多。反复注射ConA诱发免疫细胞介导的肝损伤进而发展为肝纤维化,其特征更接近于人类肝纤维化疾病病变特征。优点：免疫法造模与临床上慢性肝炎所致肝纤维化和肝硬化在发病机制上更为接近,病变过程中肝细胞受损较轻,细胞外基质以Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白沉积为主,肝组织形态清晰,有利于原位观察和分析,适合肝脏免疫病理研究。并且该法成功率高,动物死亡率较低,方法简便易行。免疫法诱导肝纤维化模型使用异源血清制品建立肝纤维化模型的方法发展日趋成熟。该法的原理是异源血清进入体内,刺激大鼠产生抗体,继而形成免疫复合物激活补体,长期的抗原刺激形成的免疫复合物沉积肝汇管区和血管壁,引起Ⅲ型变态反应造成血管炎、血管周炎等局部炎症反应,进一步刺激胶原的增生而形成肝纤维化。目前常使用猪血清、牛血清、血吸虫病血清等。用猪血清法造模,3周时候可通过免疫组化显示免疫复合物在血管壁周围沉积,4周之后纤维组织明显增多优点：猪血清法操作简便,周期较短,成功率高,结果稳定,纤维化一旦出现不易改变,在研究肝纤维化产生机制和筛选抗纤维化药物方面有一定优势。此模型一直用于研究吞噬细胞、Ito细胞及肝纤维化过程中肝内微循环的改变。缺点是免疫损伤性模型没有病毒持续复制和肝实质持续损伤的过程。BCM模型的制备是通过切断胆管或注入硬化剂等方法人为地造成肝外胆道梗阻，从而引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积，胆道内压力增高，使胆汁外渗，导致肝细胞的溶解、坏死。另外，由于肝内血管受到扩张胆管的压迫，也可造成肝细胞发生缺血和坏死，胶原组织大量沉积，向肝小叶内伸展，包围肝小叶并散布于肝细胞周围。15天复制肝纤维化。优点：诱导肝纤维化模型具有成模时间短，成本低廉，其致病因素与临床上胆汁淤积性肝纤维化极为相似，因此，该模型在用于防治肝纤维化特别是胆汁淤积性肝纤维化的药效评价中具有重要价值，但是，该模型死亡率较高，手术操作环境要求高。而且，由于该模型是通过结扎胆总管导致胆汁淤积而对肝组织发生损伤，因此，该模型不适合用于通过利胆而发挥药效的药物作用评价胆管堵塞性肝纤维化(BCM)模型SiO2在机体内诱导氧自由基的产生，过多的氧自由基会损伤组织细胞，而肝脏是易受损的的靶器官之一。同时，SiO2诱导TGF－β、PDGF等细胞因子产生，从而激活星状细胞(HSCs)，使得ECM大量沉积，导致肝纤维化的形成。