测序质量判断和测序常见问题

测序质量判断和测序常见问题DNA测序原理目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。Sanger法测序的原理Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它播们鱼具梦有腔共阀同全的柏起宿始箱点良，气但糖终望止腥在作不郊同道的睛的赖核哀苷络酸敏上袄，丘可北通融过科高觉分漂辨淹率离变贷性属凝拢胶占电跌泳扰分扫离烟大痰小登不至同信的斤片生段摊，缩慧凝笑胶伶处译理疗后据可返用匪X鼠-杜光裙胶铁片惭放屋射弱自榴显筛影投或涉非宫同达位弦素筋标咸记池进累行声检薯测袍。自碍动总化痛测社序首升先女，笛通乓过竞对携d址d侦N蚂T中P划进腹行样不顺同语的抵荧项光撕标泡记屈实扭现翁在邀一呜个汤泳寸道扇实曲现饲四扰种烈碱屠基肤判粥读喂。后咏来呈，哪各绒公椅司允有膜改妻进创了哈电朵泳们方耽法遭，饲将阁毛呀细朵管雷电咳泳泳技锡术考引订入纷了廉测约序仇仪傅，积大驶大霜提敲高蓄了栽分创辨盈率嫌。汤（晋排佣除衔了鹅横惠向龟扩穷散貌和奥泳陆道树间垂的过干捞扰针）影杜响蜡测哄序网结杂果纺的梁因款素测序反应反应组分模版引物其他标准试剂污染组分反应条件体积退火温度退火时间产物纯化样品纯度（空气，盐离子，染料，乙醇）电泳分离上样量电泳条件检测荧光激发和接受的灵敏度常键见寇问聚题反伴应咳整线体侧差钉，坊杂木峰蜜很螺多者，悦序储列运完塞全消比具不查上序狼列临能暖比造上彼，劫但豪很晚多谎地抄方楚有堂“孤突哑变纠”用，平有津“只插买入梢”够，偿有疏“刻缺营失湖”测教序狗长止度帅太骑短榴了常翻见颂问笑题急的秒原咱因反锤应馅整麦体搂差嘴，争杂昨峰招很并多姑，壶序训列垄完缓全麦比岁不揪上根药本尘没宇反驳应户，帝引片物锐和般模麻版错不飞匹痒配序狗列雪能愈比祥上犹，怨但矮很鼓多怕地腰方跌有筝“叨突烟变攻”既，正有性“威插盲入泪”钟，严有涂“偏缺罚失京”咐，撇测车序躬长原度蒸太逮短牲了有挎反颂应系，付但铺质截量吩差分手析这一五下畏原掀因咐可稿帮呆助鞠大溉家傻却移认党测荣序裁结存果况，如确岂定此是愚否雹需粱要航重棋新涛测侧序柿。分待析饥时怖应棒从殖大波到泼小汗，咸从敏整耳体铁入肃手整体比对反应整体形状具体位置原因有强平均峰宽，峰形向前拖引物降解向后拖样品降解头大脚小反应前部较好但很短，看峰形是个“大头娃娃”引物过多信号突然衰减或消失Poly结构互补结构个别位置问题70-80，100-120有C或T峰染料峰200,400有G峰乙醇峰50bp之前信号杂乱，有高峰引物二聚体个别碱基不匹配前后反应信号良好突变反应过程中突然有高峰位置不定气泡弱模版量引物引发效率无有反应信号多模版多结合位点反应信号相