酶的放射分析课件

第五节酶的放射分析

〔RadiometricMethodofEnzymeAssay〕目的与要求：掌握酶的放射分析的根本原理、特点和根本方法学。1定义:用放射性核素标记酶底物进行酶的活力测定的方法，称为酶的放射分析(RadiometricMethodofEnzymeAssay)。有六类，数百种酶可用这种方法测定活力与生物化学测定法比较：更灵敏、更特异。概述2一、根本原理和特点目的：测定酶活力测量在特定条件下〔底物浓度、酶浓度、pH、温度及时间等〕，单位时间内，酶底物被酶催化所生成的产物量3酶活力实质上是测定酶催化反响的速率该速率以浓度/时间表达指单位时间内底物的消耗量或产物的生成量〔通常多用后者〕该速率越大，酶活力越强酶活力大小用酶活力单位表示。4酶活力单位：①新国际制单位Katal〔Kat〕：1Kat指在规定条件下，每秒钟酶催化1mol底物转变所需的酶量。②旧制单位U〔Unit〕：1U指在一定条件下，每分钟酶催化1μmol底物发生转变所需的酶量。5由酶活力单位可引伸出：酶活性浓度〔Kat/L〕酶的比活力〔kat/g酶蛋白或Kat/g总蛋白〕，一般用μmol/min/mg蛋白表示比活力越高，酶的纯度越高酶的活力受底物和酶浓度制约与反响系统、反响条件等关系密切评价酶活力时，应指明所规定的条件。8酶对底物的催化反响可用下式表示:*S+E↔E*S→E*P→E+*PE：代表酶*S：酶的标记底物E*S是酶与底物形成的中间物E*P：酶与产物的复合物*P：底物经酶催化转变的产物9在反响中酶的量不变随着反响时间的延长酶可将全部底物转化为产物因此，要限定反响时间，不待底物消耗完就将产物别离并测定其放射性，用下式表达酶的活力：酶活力〔Kat〕=Pn：产物P的放射性计数率cps；S：标记底物的放射性比活度Bq/mol；E：仪器的测量效率；t：酶催化反响时间s〔秒〕。10与生物化学方法比较，最突出的特点：①灵敏度高灵敏度比传统的方法高1-3个数量级酶催化1pmol3H标记底物生成的产物放射性可达104数量级很少量酶液样品中的酶活力即可测出能在较宽的底物浓度范围内进行酶促反响，有利于酶的米氏常数Km的测定有利于竞争性抑制剂的作用研究在底物浓度很低时，竞争抑制剂的作用更能明显地显示还可以对酶样品作多倍稀释后使用，酶样品中存在的干扰物也随稀释而减少，对酶促反响的干扰亦随之减轻。11②特异性强酶的催化反响对外加底物和内源性底物无差异常用的酶活力测定法，对产物测定所使用的光谱分析法〔紫外分光光度法、荧光测定法、比色法等〕都不能区分外加底物的酶催化反响产物与内源性底物的产物样品中存在的其他内源性物质或药物也可能对光谱产生干扰酶的放射分析法是外加标记底物，测定产物的放射性因此，只有由标记底物转化的放射性产物才被测出，很容易将内源性底物转化的非放射性产物区分开不受其他内源性物质及药物干扰酶的放射分析的这种特异性更适合于分析粗酶提取液中的酶活力以及研究酶的冲动剂、抑制剂、反响条件〔pH等〕改变对酶活力的影响在方法学上同样能精简某些别离纯化步骤。12二、酶的放射分析根本方法酶液制备↓酶促反响↓终止反响↓产物与未转化的底物别离↓产物的放射性测量↓计算酶活力根本方法流程图跳转13三、利用酶促反响的其他放射分析法在酶的放射分析原理根底上,将实验设计加以调整或将标记底物直接引入体内:形成了放射酶促分析法〔Radioenzymaticassay〕和整体酶活力测定法。141．放射酶促分析法用酶和标记底物，测定生物活性物质或酶的冲动剂、抑制剂及底物含量的分析方法。〔1〕酶促同位素衍生物法〔Enzymaticisotopederiva-tivemethod〕通过特异酶的作用，使比活度的标记试剂与待测生物活性物质形成标记产物〔即衍生物〕。该产物的放射性除以标记试剂的比活度即可计算出待测物的量15准确定量须满足以下条件：衍生物的生成速率需与底物浓度成正比反响100％完成衍生物能100％回收放射化学纯度高衍生物不发生分解完全满足这些条件困难很多，产物100％回收十分困难，所以，直接实验结果不能代表客观实际，需要对计算结果进行复杂的校正16酶促双同位素衍生物技术〔Enzymaticdouble-Isotopederivatemethod〕可以克服上述缺点分析样品中先参加微量高比活度的标记物作为回收指示剂〔Recoverytracer〕再参加另一种核素标记物作为衍生物试剂经酶作用后生成双标记衍生物〔两种核素的射线不同种，或能量相差很大〕计算产物中回收指示剂的回收率，进行校正解决产物无法100％回收问题。17计算两种射线的比值18〔2〕酶的冲动剂和抑制剂测定法〔Measurementof

enzymeactivatorsandinhibitors〕根底为反响速率：酶的冲动剂在反响液中的浓度增加，反响速度加快反响速度随抑制剂浓度增加而减少酶促反响速率以产物的放射量来衡量用系列浓度的酶激活剂〔或抑制剂〕与定量的酶制剂进行定时反响别离产物测定放射性绘制待测物浓度对应产物放射剂量的反响曲线在该曲线上可获得同等反响条件下待测样品中酶激活剂〔或抑制剂〕的浓度。19为提高灵敏度，应选用与待测物有高亲和力的酶，高放射性比活度的标记底物。表46用放射酶促反响分别测量酶的激活剂和抑制剂化合物类型标记物酶磷酸吡哆醛激活剂[U-14C]酪氨酸TADcAMP激活剂[γ-32P]ATPPKcAMP激活剂[γ-32P]ATPPK抗胆碱酯酶抑制剂[1-14C]乙酰胆碱AchE氨甲蝶蛉抑制剂3H叶酸盐FR20〔3〕放射酶促饱和分析法

〔Radioenzymaticsaturaionanalysis〕原理与放射免疫分析〔RIA〕相同：待测物与其标记物竞争结合〔酶〕特异结合试剂是有限量的酶产物的放射量与待测物浓度负相关通过剂量反响曲线确定待测物浓度此法的灵敏度不如RIA等体外放射分析法，应用范围窄，实验条件要求较高很少使用。212．整体酶活力测定法酶活力是一项重要的生理指标离体法不能完全代表整体条件下酶的活力变化整体酶活力测定更能真实地反映机体的生理病理特征和规律整体酶活力测定方法：应用最多的是放射性呼气测定法用放射性核素14C或11C〔14C应用较广〕标记某些酶的底物进人体内后经酶催化而形成14CO2收集呼气中的14CO2测定其放射性来反映酶的活力。此法已用于单胺氧化酶〔MAO〕、混合功能氧化酶〔MFO〕等的酶活力测定。22整体呼气试验检测幽门螺杆菌

〔Helicobacterpglori，Hp〕Hp是人胃内唯一能