Gallios流式细胞仪操作规程

高端流式细胞仪Gallios操作规程BeckmanCoulter医学院中心实验室2022年12月Gallios操作规程注意：重新开机前先确认是否已经关机30分钟以上，以保护激光器。一、开机前检查1.检查鞘液桶并确认：外置鞘液桶是否充足，需充满1/3以上鞘液，鞘液为加有万分之一NaN2的超纯水。旋紧外置和内置鞘液桶盖子，管路与桶盖连接，无扭曲。检察废液桶并确认：及时清空废液桶，可酌情在废液桶内加入少量次氯酸钠原液，旋紧废液桶盖子，管路与桶盖连接，无扭曲。3.检查清洗液桶，确认加满清洗液。二、开机1.开启液流车电源箱开关，启动计算机。2.在出现的Window窗口对话框中输入用户名（adminstrator）和密码（password）。3.点击桌面，此时405nm、488nm、635nm激光器自动开启，如实验需要561nm激光器，可在仪器后方打开该激光器的电源。点击（工作站）图标，在用户登录对话框中，选择登陆的用户名service1，输入密码service5(密码会定期更换)，点击“Next”。4.下一窗口，点击“Connect”，启动流式细胞仪。注意：如流式细胞仪重新启动后，再次关机必须等待30分钟以上，以保护激光器。打开电源箱门，做如下检查：AIRFILTER,VACUUMFILTER必需干燥无水；WATERTRAP液体不能超过1/3；VACUUMTRAP液体不能超过1/4；检查SYSTEMVACUUM表，确认在-17~-30in.Hg；检查SYSTEMPRESURE表，确认在28~32PSI之间。注意：如SYSTEMPRESURE表计数不在上述范围内，拉出PRESUREADJUSTER钮，调节压力至30±2，将按钮复位。（第5条一般由仪器管理员每天检查）6.激光预热10-15分钟，观察流式细胞仪主机前的指示面板，“STATUS”指示灯变为绿色如图标示，且软件提示“AwaitingSample”，执行Prime，排除管路气泡后，既可以开始检测标本。三、检测标本以人双色淋巴细胞亚群为例，介绍Gallios流式细胞仪检测双色样本流程。1.实验试剂：单克隆荧光抗体：①Isotypecontrol（IgG1-FITC/IgG1-PE）；②CD3-FITC/CD19-PE;③CD3-FITC/CD4-PE;④CD3-FITC/CD8-PE;⑤CD3-FITC/CD16+56-PE。红细胞裂解液：即用型，室温保存（18-25℃）；0.01MPBS；Immunotrol质控血或者EDTA抗凝血。2.样本制备：A取5支流式试管，编号为1、2、3、4、5，分别将100μl抗凝全血或Immunotrol质控血加入1-5号试管中，小心不要将血挂在试管内壁上；B在各管中依次加入20μl的IgG1-FITC/IgG1-PE、CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD16+56-PE，涡旋混匀后，室温避光孵育20分钟；C取出试管，每管加入500μl红细胞裂解液OptiLyseC，涡旋混匀，室温避光10分钟；300g（约1200rpm）离心5min，弃去上清液；D每管加入2ml的PBS，涡旋混匀，300g离心5min，弃去上清液；E每管加入0.5mlPBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml含1-2%多聚甲醛的PBS溶液，置于4℃冰箱保存，24h内上机检测。3.建立双色方案：A选择“File”“New”“NewProtocol”B选择参数：点击工具栏中的“CytometerControl”键，选择“Acq.Setup”选项卡，点击“Parameters…”进入参数选择对话框，依实验选择所需的参数，点击“OK”，为方案选择保存路径，命名为“2CLymI”本实验所选参数为FS-INT-LIN；SS-INT-Lin；FL1-INT-Log；FL2-INT-Log。C建立该实验方案所需图形：本实验需要二个图（请同学们思考：不同的实验目的需要几幅数据显示图，怎样组合双参数散点图）①SS/FS双参数点图：单击工具栏中的（ColorDotPlot）键，X轴选择“SSINTLIN:SSINTLIN”,Y轴参数选择“FSINTLIN:FSINTLIN”，Gate参数选择“Ungated”，如需在图形中直接显示细胞相对百分含量，可在“Show%onplot前的方框中打“√”，如下图。单击OK。单击（PolygonalRegion）键，在FS/SS点图中画多边形门A，用来圈定淋巴细胞。②FL1/F2双参数散点图：单击工具栏中的（ColorDotPlot）键，X轴参数选择“FL1INTFL1LOG”,Y轴参数选择“FL2INTFL2LOG”，Gate参数选择“A”，如下图左，单击OK。在工具栏中选择键，，在FL1/FL2点图中第一个对数格处画十字象限，如下图右。③将鼠标移至该图左下角，出现“Σ”时，单击鼠标左键，显示统计。单击工具栏“Σ”图标，可编辑统计项，依据本实验所需数据要求在弹出的窗口中选择Number、%Gated、X-Mean、Y-Mean，并在“ReportOptions”下面的“MeanCalculationMathod”选项前打“√”，在“SelectNumeric”下面选择“Percent”，在“Precision”处指定小数点后位数（最多4位）如下图。D设定坐标轴名称：单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“Parameters”栏中的“FL1INTLOG”,在对应的“Stain”栏中输入“IgG1-FITC”；选择“FL2INTLOG”，在对应的“Stain”栏中输入“IgG1-PE”，单击“OK”；E单击工具栏上的保存方案F单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“SelectParametertoedit”栏中的“FL1INTLOG”,在对应的“Stain”栏中输入“CD3-FITC”；选择“FL2INTLOG”，在对应的“Stain”栏中输入“CD19-PE”，单击“OK”；G单击菜单栏“File”→“SaveProtocolAs…”，在弹出的对话框中输入“2CLymCD3-19”，单击“Save”；H单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“SelectParametertoedit”栏中的“FL1INTLOG”,在对应的“Stain”栏中输入“CD3-FITC选择“FL2INTLOG”，在对应的“Stain”栏中输入“CD4-PE”，单击“OK”；I单击菜单栏“File”→“SaveProtocolAs…”，在弹出的对话框中输入“2CLymCD3-4”，单击“Save”；J单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“SelectParametertoedit”栏中的“FL1INTLOG”,在对应的“Stain”栏中输入“CD3-FITC”；选择“FL2INTLOG”，在对应的“Stain”栏中输入“CD8-PE”，单击“OK”；K单击菜单栏“File”→“SaveProtocolAs…”，在弹出的对话框中输入“2CLymCD3-8”，单击“Save”；L单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“SelectParametertoedit”栏中的“FL1INTLOG”,在对应的“Stain”栏中输入“CD3-FITC”；选择“FL2INTLOG”，在对应的“Stain”栏中输入“CD16+56-PE”，单击“OK”；M单击菜单栏“File”→“SaveProtocolAs…”，在弹出的对话框中输入“2CLymCD3-16+56”，单击“Save”。4.建立实验组合（Panel）A单击菜单栏“File”→“New”→“NewPanel…”，在弹出的对话框中“PanelName”栏中输入组合名称“2CLym”，在“NoofTest”栏中输入“5”（表示为5个检测管做组合），在“ExporttheresultsofthispaneltotheReportGenerator”单击“Next”；B在新弹出的窗口设置第1管检测选项：选择“Useplotsandgatsfromprotocol”，在其下拉方案中选择“2CLymisotype.PRO”，选择“UseInstrumentSettings”和“UseRegionsfromthisprotocol”，点击“Next”;C在新弹出的窗口设置第2管检测选项：选择“Useplotsandgatsfromprotocol”，在其下拉方案中选择“2CLymCD3-19.PRO”，选择“Useinstrumentsettingsfromprevioustest”和“UseRegionsfromthisprotocol”，点击“Next”;D其余3管分别在下拉方案中选择“2CLymCD3-4.PRO”、“2CLymCD3-8.PRO”、“2CLymCD3-16+56.PRO”，其余的选项不变，最后点击“Finish”5.数据获取条件设定：A在“File”“WorkspacePreferences”，弹出对话框中选“LMDFileName”选项卡，选择“SampleID1”、“SampleID2”、“Y2KDate”、“TagNumber”和“Starteachpanelat001”，点击“OK”B点击“View”“CustomizeWorklistColumns”在弹出对话框中选择选择“Panl”、“Protocol”、“RegionSource”、“Cytocytings”、“TubID”、“CarouselNo”、“location”、“SampleID1”、“SampleID2”，点击“OK”C获取停止条件设定：选择工具栏中的“”在“AcquisitionSetup”选项卡中完成①设置获取时间：“Limits”中点击“SetTimes”，在弹出的对话框中的将“AcquisitionTime(s)”设为300；“ElapsedTime(s)”设为500②细胞总数设定：在“Limits”中的“MaximumEvents”（总细胞数）设定为100000③门内细胞数设定：即设定某一群细胞获取一定数量后停止。如我们设定获取淋巴细胞2000停止，在方案右键点击中任何一张Gating到淋巴细胞的图形上。本实验在FL1/FL2的散点图上点击右键，选择“Format”，弹出对话框中选择“StopandSave”选项卡，在“UseStopCondition”前打√，在“MaximumEvents”处设定为2000。时间和细胞数三个限制同时设定，最先满足任一条件即停止获取；D单击，在“SetupMode”前打“√”，在“Baselineoffset”前不打“√”，将样本管充分混匀，置上样盘某一位置，在软件下方“AcquisitionManager”输入1号样本管所在转盘号，如“1”和位置，如“1”；E设定阈值：在“AcquisitionSetup”选项卡中设定阈值，扣除碎片。通常以FS为阈值，设定为100，该参数可根据点图中碎片的多少进行相应调整，在保证目的细胞群完整的前提下，尽量扣除碎片。注意：到此处为止，所有的实验方案、进样工作组都已经设置完毕，如果之后要进行类似的实验，可以直接调用该方案，不必重复设置。调用原有的实验方案：从File中点击openprotocal→打开适合的实验方案→再点击File→Saveprotocalas重新保存到最新日期文件夹中；新建进样工作组：点击Newworklist“”，再点击“”添加样品管(样品管可自行命名，比如：sampleID1:学生名，sampleID2：荧光燃料名称)，按编号1、2、3、、、、依次将样品管放入对应编号的测样卡槽中。F单击，仪器自动从第一个样品开始检测，第一个样品为同型对照（有些是纯阴性对照）。（请同学们思考：同型对照或纯阴性对照起什么作用？准备同型对照样品或纯阴性对照要注意哪些事项？需要利用同型对照调节仪器的哪些参数？）单击“Cytometercontrol”，进行参数条件设置，电压调节：单击“Volts”，调节FS和SS的电压（Volts）和增益（Gain）（如下图A和B；或选中“CytometerControl/AcquisitionSetup”中“QuickSet”,用图形的快速滚动条调节）使SS/FS散点图分群清晰，分布良好，调节A门位置，使其圈定淋巴细胞（如下图C和D）。调节FL1和FL2电压，使FL1/FL2点图中的细胞群体位于左下象限，点击，保存实验条件。去掉“SetupMode”前“√”，收集数据。ABCDG1号样本管收集结束，自动检测2号管，(请同学们思考：为什么以CD3-FITC/CD19-PE做第二个样品？它起什么作用？用它来对仪器调节什么？)在“SetupMode”和“QuickComp”前打“√”，在“Baselineoffset”前不打“√”。荧光散点图上出现快速调节滚动条，直接拉动垂直滚动条，调节FL2-FL1%的补偿，使FITC单阳细胞落到右下象限，使B3和B4区内细胞群平均荧光强度Y-Mean一致（差值<0.1）。拉动水平滚动条，调节FL1-FL2%的补偿，使PE单阳细胞群落到左上象限，使B1和B3区内细胞的平均荧光强度X-Mean一致（差值<0.1），点击，保存条件。在“Baselineoffset”前打“√”，收集数据，到淋巴细胞2000，自动停止。H2号样本管数据收集完毕，仪器按照当前的参数条件，自动依次收集3、4、5号样本管数据。5.实验数据分析和实验报告设置A打开Gallios软件，选择“WorkOffline”，进行脱机分析。选择“File”“New”“NewProtocol”，单击工具栏中的（ColorDotPlot）键，画SS/FS和FL1/FL2散点图。在SS/FS上作多边形门A，在FL1/Fl2上做十字门并Gating到门A。B创建FLOWPAGE：①选择工具栏或者“Insert”“BlankFlowPAGE”②鼠标左键选中以上绘制好的参数图，拖到FlowPAGE上③选择“Insert”“FlowPAGETextbox”，在FlowPAGE上预定输入文本的位置点击鼠标左键，键入文本。C在右侧的资源导航栏“ResourceExplorer”，点击，之后点击登陆用户名的文件夹如“user”，即显示所有收集的数据。左键点击“2CISOTYPE001.LMD”，拖到散点图上。调整A门圈淋巴细胞，沿阴性细胞群边缘调节十字门位置。单击，在弹出的对话框中选择“AnalysisProtocol”文件夹，为方案命名（2CLymANA.PRO），点击“Save”保存方案D按上述步骤依次代入分析第2、3、4、5管数据，FLowpage图形自动更新注意：FlowPage上的图形和工作区中的图形是同步的，所以当您拖曳一个新的LMDData到工作区时，打印页中的图形也会随之更新注意：不推荐学生们在线上使用该工作站进行数据分析，以免占用机时，或造成工作站不稳定。对今后使用仪器获得数据的学生，另行拷贝Ka