miR-3529-3p通过下调E2F3基因表达抑制卵巢癌SKOV-3细胞增殖的机制研究

miR-3529-3p通过下调E2F3基因表达抑制卵巢癌SKOV-3细胞增殖的机制研究

万淑琼鲍群丽黄耿姜艳萍张青冬王楚平1鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）妇科，黄石435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）检验科，黄石435000；3鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科，黄石435000卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，因其组织结构较为隐蔽，卵巢癌早期的临床特征并不明显，大部分卵巢癌患者初诊时已发生转移，严重威胁女性生命安全［1-2］。卵巢癌的临床治疗主要是手术治疗，然而术后的高复发率严重影响患者预后［3］。寻找早期的诊断标志物及治疗靶标成为卵巢癌研究的重点。微小RNA（miR）是一类保守的单链RNA，属于非编码内源性RNA，长度约为23个核苷酸［4-5］。miR通过在转录后水平影响靶基因的表达，在细胞的生理和病理过程中发挥着重要作用［6-7］。已有大量研究显示，miR作为调控因子参与卵巢癌细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等功能［8-9］。2021年1月至5月，本研究拟探讨miR-3529-3p对卵巢癌细胞增殖的影响及作用机制。材料与方法1、细胞与主要试剂DMEM培养基购于美国Gibco公司；NCmimic、miR-3529-3pmimic购于上海碧云天生物技术有限公司；卵巢癌细胞SKOV-3购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；CCK-8试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；结晶紫购于美国Sigma公司；Lipofectamine3000、Opti-MEM培养基购于美国LifeTechnologies公司；反转录试剂盒和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购于大连宝生物公司；一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国CST公司。2、细胞培养和转染将SKOV-3细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱内培养。在24孔板内接种处在对数生长期的SKOV-3细胞，采用Opti-MEM培养基分别稀释miR试剂和Lipofectamine3000试剂，充分混匀冰上孵育15min，分别加预混液至24孔板。转染NCmimic的SKOV-3细胞为NC组，转染miR-3529-3pmimic的SKOV-3细胞为miR-3529-3p组。3、qRT-PCR检测miR-3529-3p、E2F转录调节因子3（E2F3）mRNA表达采用TRIzol试剂收集细胞并提取RNA，按照反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒说明书分别进行反转录和qRT-PCR，引物序列如下，E2F3引物正向序列5’-TGACCCAATGGTAGGCACAT-3’，反向序列5’-CATCTAGGACCACACCGACA-3’；miR-3529-3p引物正向序列5’-GTGGGGAGGGAAGGGTCATGCA-3’，反向序列5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’。以U6为miR-3529-3p的内参基因，以GAPDH为E2F3的内参基因，按照2-ΔΔCt法计算miR-3529-3p、E2F3信使RNA（mRNA）的表达。4、CCK-8法检测SKOV-3细胞增殖情况取两组处于对数生长期的SKOV-3细胞制成单细胞悬液，按2×103个/孔接种至96孔板，分别在第1、2、3、4天，每孔加入30μlCCK-8试剂，培养箱继续培养3h，使用酶标仪检测于450nm处每孔的吸光度（A）值。每个样本采用4个复孔，实验重复4次。5、集落形成实验检测SKOV-3细胞增殖能力取两组处于对数生长期的SKOV-3细胞制成单细胞悬液，按2×103个/孔接种至6孔板，连续培养10d后，加入甲醇进行固定，加入结晶紫进行染色，流水冲洗多余染液，计数集落形成数。每个样本采用4个复孔，实验重复4次。6、生物信息学软件预测miR-3529-3p的靶基因采用miRNAMap数据库（http：//.tw/）预测miR-3529-3p的靶基因，E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。7、蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测靶基因蛋白的表达采用细胞裂解液裂解SKOV-3细胞，提取总蛋白，在SDS凝胶中进行电泳，采用硝酸纤维素膜进行转膜。采用5%脱脂牛奶封闭，在一抗中孵育过夜，加入二抗并孵育2h，均匀加入ECL显影液，在凝胶成像仪中显影、拍照。8、统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量数据符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、各组SKOV-3细胞中miR-3529-3p的表达SKOV-3细胞转染24h后，NC组和miR-3529-3p组SKOV-3细胞中miR-3529-3p的表达分别为（1.01±0.07）和（9.55±1.50），miR-3529-3p组相比NC组上调了9.46倍（t=5.68，P＜0.01）。2、miR-3529-3p对SKOV-3细胞增殖活性的影响与NC组相比，miR-3529-3p组SKOV-3细胞在第2、3、4天时增殖活性均有下降趋势（均P＜0.05），表明miR-3529-3p过表达抑制卵巢癌SKOV-3细胞增殖活性（图1）。图1高表达miR-3529-3p对SKOV-3细胞增殖能力的影响3、miR-3529-3p对SKOV-3细胞集落形成能力的影响NC组和miR-3529-3p组集落形成数分别为（120.50±18.38）个和（56.25±10.78）个，差异有统计学意义（t=3.02，P＜0.01），提示miR-3529-3p过表达可抑制卵巢癌SKOV-3细胞的集落形成（图2）。图2miR-3529-3p对SKOV-3细胞集落形成的影响（结晶紫染色×10）4、生物信息学软件预测miR-3529-3p的靶基因如图3，采用miRNAMap数据库预测miR-3529-3p的靶基因可能是E2F3。图3miR-3529-3p与E2F3mRNA的互补配对区域5、miR-3529-3p对E2F3mRNA表达的影响NC组和miR-3529-3p组SKOV-3细胞中E2F3mRNA的表达分别为（1.03±0.14）和（0.27±0.05），表明miR-3529-3p可抑制E2F3mRNA的表达（t=5.60，P＜0.01）。6、miR-3529-3p对E2F3蛋白表达的影响Westernblot结果表明，与NC组相比，miR-3529-3p组SKOV-3细胞E2F3蛋白减少，细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达降低（图4）。图4高表达miR-3529-3p对E2F3蛋白表达的影响讨论miR的异常表达与卵巢癌的发生、发展、转移相关［10-11］。miR如miR-29c-3p［12］、miR-34a-5p［13］可通过干扰癌基因表达抑制卵巢癌的增殖，诱导细胞凋亡，增强化疗敏感性，产生抑癌作用。miR如miR-665［14］、miR-378a-3p［10］可通过干扰抑癌基因表达促进卵巢癌细胞的增殖和转移，与患者的不良预后相关，表现为促癌作用。miR-3529-3p在卵巢癌细胞中的作用尚不明确。本研究显示，过表达miR-3529-3p可显著抑制卵巢癌SKOV-3细胞的增殖活性，miR-3529-3p在卵巢癌细胞中表现为抑癌作用。miRNA序列主要通过与对应靶基因mRNA的3’非翻译区不完全互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接诱导其降解，导致靶基因蛋白表达降低［12］。本研究采用miRNAMap数据库预测，miR-3529-3p和E2F3mRNA存在互补反应元件。E2F3蛋白属于E2F转录因子家族成员，通过调控细胞周期促进细胞的增殖［15］。E2F3蛋白在膀胱癌、肝癌、胃癌等肿瘤中呈高表达，在细胞的恶性转化中发挥重要作用［16］。E2F3蛋白在卵巢癌癌组织中的表达高于癌旁组织，其表达水平伴随临床分期和肿瘤恶性程度发展而增高，沉默E2F3基因表达可抑制卵巢癌细胞的增殖和顺铂耐药性［15］。本研究显示，过表达miR-3529-3p后SKOV-3细胞中E2F3基因的表达明显降低，表明miR-3529-3p可靶向抑制E2F3的表达，E2F3可能是miR-35