一种离体皮肤测试法在美白保湿美容中的应用

一种离体皮肤测试法在美白保湿美容中的应用

随着中国人民生活水平的提高，人们对美的追求也不断提高。皮肤美白和皮肤清洗一直是亚洲人最关心的皮肤健康和美丽的需求之一，深受消费者喜爱的补水产品也已成为消费者的焦点。目前美白护肤活性成分主要是通过抗氧化、抑制酪氨酸酶活性等机理实现美白效果，如广泛应用的维生素C和熊果苷等成分。烟酰胺是一种水溶性维生素，长期以来因为其消炎的作用而用于皮肤相关疾病的口服治疗。近年来的研究发现，将角质形成细胞与黑素细胞共同培养，烟酰胺能够阻碍黑素小体在黑素细胞与角质形成细胞间的传递传统美白和保湿功效的研究多基于人体的临床测试，主要测试指标包括皮肤角质层含水量、皮肤黑红度、皮肤LFontana-Masson染色作为黑色素最常用的染色方法，已被广泛应用在皮肤美白活性测试中水通道蛋白3(AQP3）已被证实不仅具有高透水性，而且还可以作为甘油的有效转运载体本研究通过离体皮肤模拟人体敷面膜的过程，采用Fontana-Masson染色，AQP3、Claudin-1和Filaggrin免疫荧光染色对自研面膜的美白和保湿功效进行测试，从而建立基于离体皮肤的美白和保湿功效测试方法。1实验部分1.1培养基和试剂测试样品为本公司自研的烟酰胺细致提亮安瓶面膜（市售），安瓶部分为精华液，其中含有4%烟酰胺，面膜基材为由海藻纤维制成的高吸收性膜布。从一名接受包皮手术的健康男性捐献者（19岁）获得一块用于离体皮肤测试的皮肤组织。面膜：自然堂烟酰胺细致提亮安瓶面膜（批号：232009152），伽蓝（集团）股份有限公司；DMEM培养基（货号：10569044），美国赛默飞世尔科技公司；AQP3（货号：sc-20811），圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司；Filaggrin（货号：vp-F706），北京博蕾德生物科技有限公司；Fontana-Masson试剂盒（货号：ab150669）、Claudin-1（货号：ab211737）抗体、GoatAnti-RabbitIgGH&LAlexflour568（货号：ab175471）、DonkeyAnti-MouseIgGH&LAlexaFluor568（货号：ab175700）和DAPI（货号：ab104139），艾博抗（上海）贸易有限公司；青霉素（货号：41-501-25）、链霉素（货号：41-502-25）、两性霉素B（货号：03-029-1），广州华粤瑞科科学器材有限公司；O.C.T(optimalcuttingtemperaturecompound）冷冻切片包埋剂，德国徕卡公司。Scope.A1显微镜，德国蔡司集团。1.2实验方法1.2.1培养基皮肤制备用灭菌后的剪刀和镊子将皮肤的脂肪层和多余的真皮层移除，使之均匀平整。采用DMEM和双倍的抗生素培养基（青霉素、链霉素和两性霉素B）冲洗皮肤2次，保证干净无杂质。采用皮肤圆环打孔器（直径5mm）和锤子在皮肤上打孔，获得原片皮肤若干，将得到的皮肤圆片放在培养皿中，加少量上述培养基润湿真皮层，表皮层接触空气，形成空气液体交换界面。以上述方法将面膜打成同样大小的面膜圆片若干。1.2.2皮肤圆片的制备分别设置空白对照组和面膜组，不使用面膜的皮肤圆片单纯培养作为空白对照组，使用面膜的皮肤圆片为面膜组。每组设置3个平行样本。面膜组的处理方法：将上述面膜圆片敷在大小一致的皮肤圆片上，尽量做到完整覆盖。每天贴1次面膜，每次15min，随后涂抹3μL安瓶精华液，共使用5天。培养结束后，空白对照组和面膜组均采用质量分数10%的福尔马林固定液和O.C.T冷冻切片包埋剂固定分别处理皮肤圆片。用质量分数10%的福尔马林固定液处理的皮肤圆片经脱水、石蜡包埋制成石蜡切片；O.C.T固定放在-80℃制成冰冻切片。以备之后进行组化实验。1.2.3免疫荧光染色采用Fontana-Masson染色法对制备好的空白对照组和面膜组石蜡切片进行染色，以探究样品的美白功效。采用Claudin-1抗体及GoatAnti-RabbitIgGH&LAlexflour568和DAPI进行免疫荧光染色，以探究样品的紧致锁水功效。采用AQP3抗体及DonkeyAnti-MouseIgGH&LAlexflour568和DAPI进行免疫荧光染色，以探究样品的输水保湿功效。用荧光显微镜进行拍照。1.2.4染色照片的定量分析采用Image-ProPremier9.2(MediaCybernetics，美国）图像处理软件对染色照片进行定量分析。采用SPSSStatistics21.0(IBM，美国）数据处理软件进行数据分析。统计分析前对各参数进行正态分布和方差齐性检验。采用t检验或秩和检验，比较面膜组和空白对照组的阳性率和荧光强度值，并进行显著性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义，标记为“*”；P<0.01和P<0.001表示差异具有极显著统计学意义，分别标记为“**”和“***”。2结果与讨论2.1金属银的量表b如图1所示，在离体皮肤表皮层的基底层附近硝酸氨银与黑色素作用还原为黑色的金属银，图1a和1c的黑色程度要弱于图1b和1c。从后文归纳整理的表1和图5的定量分析结果来看，面膜组的阳性率（6.23%）低于空白对照组（10.3%），且差异非常显著；面膜组（5713068lum/pixel2.2aqp3表达样品在离体皮肤上的AQP3免疫荧光染色结果如图2所示。可以看出，AQP3在靠近基底层和棘层的位置表达。空白对照组图2b和2d中AQP3的表达较为微弱，仅在25倍下才能看出有部分表达，而面膜组图2a和2c显示AQP3表达均清晰可见。从后文归纳整理的表1和图5的定量分析结果来看，空白对照组的阳性率和荧光强度（2.80%,457714lum/pixel2.3claudin-1表达量样品在离体皮肤上的Claudin-1免疫荧光染色结果如图3所示。可见，Claudin-1主要表达于表皮基底层至颗粒层的角质形成细胞膜上。面膜组图3a和3c的Claudin-1表达量明显高于空白对照组图3b和3d，且结构更加完整。从后文归纳整理的表1和图5定量分析结果可知，面膜组的阳性率（22.0%）高于空白对照组（9.17%），且差异非常显著；面膜组的荧光强度（3802743lum/pixel2.4rin皮肤测试当表皮屏障发生改变时，较为显著的特征是包膜蛋白Filaggrin的合成量减少使用该面膜5天后，皮肤状态有以下变化：（1）皮肤黑色素含量显著降低，黑素阳性率由10.30%降至6.23%，黑色素强度也由10460770lum/pixel3离体皮肤测试方法本研究建立了一种基于离体皮肤的化妆品功效测试方法，并通过一款面膜对该方法的可靠性进行了验证。结果显示，受试面膜可以有效降低黑素阳性率，提高AQP3、Claudin-1和F