生物技术概论-基因工程

生

物

技

术

概

论基

因

工

程南方医科大学生物技术学院

马骊二〇〇六年五月十一日第一页，共一百三十八页。重组DNA技术的定义种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的

稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子

克隆技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。第二页，共一百三十八页。基因工程的定义上游技术

下游技术上游技术下游技术基因工程的理论基础不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件如启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列——分子生物学原理筛选、修饰蛋白质生物合成的翻译调控元件如SD序列、mRNA非编码区、密码子——分子生物学原理基因工程菌的增殖及稳定生产——生化工程学原理第五页，共一百三十八页。基因工程的支撑技术基因工程的基本条件A

用于核酸操作的工具酶限制性内切核酸酶DNA连接酶

DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性内切核酸酶A中特定核苷酸序列，并在合适反应定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OHNA片段的内切脱氧核苷酸酶。基因工程中所用的是II型酶。属名

种名

株名Haemophilus

influenzae

d嗜血流感杆菌d株Hind

III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第九页，共一百三十八页。1、限制性内切酶的识别顺序识别序列2、限制性内切酶的酶切位点酶的作用下，DNA双链上磷酸二酯键断开酶切位点，用

表示。酶切位点位于识别序列的侧。如：G

AATTC、

GATC。不同的酶切割DNA分子后产生的末端不同：5’粘性末端、3’粘性末端、平末端。第十一页，共一百三十八页。-

-

-G-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-G-

-

--

-

-G-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-G-

-

--

-

-C-T-G-C-A-G-

-

--

-

-G-A-C-G-T-C-

-

--

-

-C-T-G-C-A-OHP-G-

-

--

-

-G-POH-A-C-G-T-C-

-

--

-

-C-A-G-C-T-G-

-

--

-

-G-T-C-G-A-C-

-

--

-

-C-A-G-OHP-C-T-G-

-

--

-

-G-T-C-POH-G-A-C-

-

-同裂酶来源不同，但具有相

的识同。I和Bst

I：识别GGATCC。同尾酶：有些限制性内切酶虽识别序列不同，但酶切产生的DNA片段具有相同的末端。如：Taq

I、Cla

I和Acc

I，酶切均产生5’-CG末端。第十五页，共一百三十八页。限制性内切酶酶切反应的操作0-50

mM

低盐酶100

mM

中盐酶150

mM

高盐酶Volume20

-

100

ulT

T37

℃

1

-

1.5

hr限制性内切酶的多酶联合酶切原则上可以同时酶切，但应注意：BamH

I

Sma

I5’

…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’

…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’

…

GCTACATG3’

…

CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ggcccAagcgta…5’5’

…GCTACATGGATCCC3’

…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCaagcgta…5’第十七页，共一百三十八页。影响限制性内切酶活性的因素DNA样品的纯度DNA样品的甲基化程度酶的缓冲液性质第十九页，共一百三十八页。DNA样品的纯度：加大酶的用量，1mg

DNA

用10U

酶加大反应总体积延长反应时间DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中dam甲基化酶在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的有Bcl

I

Mbo

I等。大肠杆菌中dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的有EcoR

II等哺乳动物中甲基化酶在5’CG3’序列中C5位上引入甲基。酶的缓冲液性质：高浓度酶高浓度甘油低离子强度极端pH值等5’GAATTC3’5’AATT3’。DNA连接酶DNA连接酶T4

DNA连接酶用途：提高平端连接效率的方法加大连接酶用量（10倍于粘端的连接）；加大平末端DNA片段的浓度；加入10%PEG

8000；加入单价阳离子（NaCl），终浓度150-200

mM。DNA聚合酶用途：记的DNA探针5’

dNTP5’

ppp

dA（-32P-dATP）5’

…

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’3’

…

C-G-A-G-

-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’DNA

pol

I

Mg2+DNA

pol

I特性：具有5’→3’DNA聚合酶活性、5’→3’和3’→5’外切核酸酶活性。-

-

-

-A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’nickDNase

I5’

…

G-C-T-C

A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’3’

…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’第二十六页，共一百三十八页。Klenow酶Klenow酶特性：用途：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端；DNA片段的同位素末端标记；cDNA第二链的合成；双脱氧末端终止法测定DNA序列。补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端：-

-

-G-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-G-

-

--

-

-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-

-

-DNA片段的同位素末端标记：…

G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C

…

5’Klenow5’

ppp

dA（

-32P-dATP）5’

…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…

5’第二十九页，共一百三十八页。T4

DNA聚合酶特性：在无dNTP时，从3’-OH端外切；在只有1种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在4种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；DNA片段的同位素末端标记。切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端：-

-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G

…

3’’

…

C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5T4

DNA

pol5’

…

G-C-T-C-

OH

P-G-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-G-P

HO

-C-C-T-C

…

5’第三十一页，共一百三十八页。反转录酶特性：用途：核酸酶单链核酸外切酶：切酶VII（ExoVII），不需Mg2+；双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），特异性从3’端核酸外切酶（Exo），特异性从5’端外切；单链核酸内切酶：S1核酸酶，内切单链DNA或RNA、带缺口或缺刻的双链DNA；单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶，用于诱发DNA突变。第三十三页，共一百三十八页。Bal

31核酸酶EcoRIABCEcoRIB

CABCAAC核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：碱性磷酸单酯酶（CIP、BAP

）

：T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）用于探针的末端同位素标记。B

用于基因克隆的载体载体的功能及特征质粒噬菌体或病毒DNACos质粒人工染色体载体载体的功能及特征载体的功能：载体应具备的条件：特征:1、质粒（plasmid）质粒的构建pSC101ColE18.8

kb

拷贝数5四环素抗性标记基因Tcr6.5

kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124

ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr人工构建的质粒分成如下几类：高拷贝质粒低拷贝质粒温敏质粒

测序质粒

整合质粒穿梭质粒表达质粒探针质粒pUC18

/

19：拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS）颜色选择标记lacZ’用于基因克隆和测序GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19颜色选择标记lacZ’的显色原理:pUC18/19PlaclacZ’MCS-半乳糖苷酶的-亚基底物：5-溴-4-氯-3-吲哚X-gal）质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染沸水浴法质粒DNA纯度低、快速、操作简便碱裂解法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间2、噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率地感染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，在一定条件下这两种状态会相互转化。3’3’CCCGCCGCTGGA

5’COS5’

TCCAGCGGCGGGGCOScosE.coli的噬菌体DNA:75-105%36

-

51

kb噬菌体的感染周期：E.coli吸附注入复制包装裂解噬菌体的溶原状态：（溶菌状态）溶原状态-DNA载体的构建缩短野生型-DNA长度，可提高装载量。野生型

-DNA中间40-50％的片段为生长非必需，根据切除多少，将

-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体1、缩短长度：野生型

-DNA包装上限51kb，只有当插入的外源DNA片段≤2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。插入型载体：如

gt系列。体外包装插入位点载体长度：36

kb体外包装插入片段0-15

kb载体长度：26

kb体外包装插入片段插入片段大小：10-25

kb取代型载体：2、删除重复的酶切位点方法：3、加装选择标记免疫功能类标记：如imm434-噬菌体进入溶菌imm434基因编码一种阻止循环的阻遏物。空载体进入E.coli后，建立溶原状态，细菌生长慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入imm434基因时，基因灭活，进入溶菌循环，形成透明斑。颜色反应类标记：如lacZ-DNA重组分子的体外包装：-DNA作为载体的优点：25

kb动植物病毒克隆载体常用的动物病毒载体：用于构建克隆载体的植物病毒：3、cos质粒（cosmid）25kbcos质粒载体的特点：45

kb4、人工染色体载体将细菌接合因子或酵母染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即构成人工染色体载体。50-300

kb350-400

kb。C

目的基因的获得直接从染色体DNA中分离化学合成法从mRNA合成cDNAPCR法通过构建基因文库分离目的基因用限制性内切酶切割基因组DNA，得到很多与基因大小相当的DNA片断，把这些片段混合物随机插入载体，转化大肠杆菌，做成基因组文库，再通过核酸分子杂交，选择出含目的基因的DNA片断。仅适用于原核基因的分离。1、直接从染色体DNA中分离2、化学合成法小片段粘接法：12-15

bp补钉延长法：12-15

bp20-30

bp大片段酶促法：40-50

bp采用一定方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成cDNA，除去RNA链后，再用DNA聚合酶I（或Klenow）合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法可得到可表达的完整基因。3、从mRNA合成cDNA双链平头cDNA使用下列方法克隆入载体：直接与载体连接；加人工接头引入酶切位点；注意：加接头前，先将DNA甲基化平头两端分别加同聚物尾。使用PCR法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或两侧序列，通过合成与模板互补的上下游引物，扩增目的基因。由Taq

DNA聚合酶扩增的PCR产物，3’端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基--A，可用T载体克隆。4、PCR法扩增目的基因基因文库（gene

library

or

gene

bank）：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在。5、通过构建基因文库分离目的基因根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含全部基因）cDNA文库（含全部蛋白质编码的结构基因）基因组文库基因组文库：cDNA文库cDNA文库：几种载体的最大装载量比较：基因组文库构建的技术性问题：基因组DNA的制备：为最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，基因组DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂。常规方法制备的染色体DNA长度100kb左右，如先将细胞固定在低融点凝胶中，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000

kb的DNA片段。基因组DNA的切割：超声波处理：DNA片段呈平头末端，需加装人工接头；部分酶切法：严禁外源DNA片段之间的连接！从基因文库中筛选目的基因：根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选根据目的基因特异性表达进行筛选根据目的基因已知核苷酸序列制备探针，对基因文库一系列克隆子的DNA分子进行杂交，能杂交的克隆就含有目的基因，进一步对阳性克隆DNA进行测序鉴定。根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：根根据据目目的的基基因因特特异异性性表表达达进进行行筛筛选选：：··

·

·

····

·

·

···

·

·

·根据目的基因特异性表达进行筛选：菌落转膜·

·

·

·菌落转膜菌落转膜菌落转膜杂交杂交杂交杂交根总mRNA探针叶总mRNA探针含目的基因菌落根cDNA文库叶cDNA文库根cDNA文库叶cDNA文库阴性反应克隆子根特异性表达的目的基因差显杂交筛选法示意图D

用于基因转移的受体菌或细胞受体细胞应具备的条件实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件实验室常用的基因工程受体大肠杆菌酵母菌哺乳动物细胞各种基因工程受体的特性大肠杆菌：酵母菌：哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）4

基因工程的操作过程基因工程的操作过程A

DNA的体外重组（切与接）匹配粘性末端的连接EcoR

I5"G

CTTAAG5"

AATTC5"GCTTAA

5"5"G5"AATTC退火5"G

CTTAA5"AATTCGT4-DNA

ligase5"5"GAATTC

CTTAAGGAATTC

CTTAAGGCTTAA5"5"GAATTCG不同粘性末端的连接BamH

I5"5"GGATCC

CCTAGGGGATCC

CCTAGG5"GCCTAGG5"

GATCC5"CTGCA

G5"GACGTC3"T4-DNA

ligaseCGATCC

GCTAGG5"5"GGATCG

CCTAGC5"CTGCAG

GACGTC5"Pst

I3"T4-DNA

pol切平5"C

G5"GCKlenow补平5"GGATC

CCTAG5"

GATCCCTAGGGCTTAA

5"5"5"G5"

AATTCT4-DNA

ligase5"5"EcoR

I

linker5"5"T4-DNA

ligaseGCTTAA5"5"GGAATTCGG5"5"G

AATTC

CTTAA

G平末端的连接－加linkerT4-DNA

ligase5"GGATC

CCTAG5"

GATCCCTAGG5"5"TdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGGGGGGGTTAAGGATCCCCCCCCCTAG退火5"5"GGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGG平末端的连接－加同聚尾5"5"5"

GATCCccccccCTAGG5"粘性末端的更换BamH

I5"5"GGATCC

CCTAGGKlenow补平5"GATCCG5"G

CCTAG5"5"5"5"T4-DNA

ligaseGGATC

CCTAG5"GATCC

CTAGG5"5"5"EcoR

IGGATCGGAATTCCGATCC

CCTAGCCTTAAGGCTAGGGGAATTCC

CCTTAAGGEcoR

I

linkerBamH

I提高载体和外源DNA连接效率的方法：B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）转化细胞的扩增重组DNA分子导入原核细胞Ca2+诱导转化法：适用于革兰氏阴性菌（如E.coli），原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。电穿孔转化法：噬菌体DNA的转染：重组DNA分子导入哺乳动物细胞病毒颗粒转染法

磷酸钙转染法脂质体介导法DEAE-葡聚糖转染法聚阳离子-DMSO处理转染法显微注射转基因技术病毒颗粒转染法:磷酸钙转染法：DNA-磷酸钙哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的沉淀物，使DNA转入细胞。先将待转染的重组DNA同CaCl2混合，随后缓慢加入Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附在培养的细胞表面，达到转染目的。脂质体介导法:重组DNA分子导入植物细胞影响转化效率的因素：载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：载体的空间构象：插入片段的大小：受体细胞方面：转化方法方面：受体细胞的预处理：供受体的比例：转化方法：转化细胞的扩增C

转化子的筛选和鉴定（检）根据载体标记筛选：抗药性筛选法：ROPROISal

IBamH

ITcrPvu

IPst

IPst

IEcoR

ICla

IHind

IIIHind

IIBal

IAp

rpBR3224363

bpori将外源DNA片段插入BamHI、Sal

I位点：非重组子：Apr、Tcr重组子：Apr、Tcs先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生长、但在Ap+Tc平板上不长的转化子为重组子ApAp+Tc影印挑选操作：显色筛选法：载体分子上携带颜色反应标记，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）。lacZ"基本操作：目的基因序列检测：限制性酶切图谱法DNA杂交法PCR法DNA序列测定1、限制性酶切图谱法：pUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’ori用BamH

I酶切：重组子：2.7

kb+4.0

kb空载体：2.7

kb如外源DNA片段也是2.7

kb，可用单一切口的酶将质粒线型化，通过其长度来鉴定是否为重组子。pUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriEcoR

IPst

IpUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’ori4

kSph

IHind

IIIEcoR

I2、DNA杂交法：杂交探针的制备：探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性）足够长度（至少12

bp）内部不含互补区探针的制备方法和来源：人工合成cDNA合成杂交探针标记方法：DNA

pol

I

介导的缺口前移标记逆转录酶介导的反转录标记T4-PNP介导的末端标记ABC荧光标记ABC显色酶标记地高辛系统标记1）DNA聚合酶介导的缺口前移标记:Mg2+5‘

dNTP5‘

ppp

dA（

-32P-