实验二细胞内碱性蛋白的显示- 组蛋白的显示

实验一 细胞内碱性蛋白的显示-

组蛋白的显示—

、实验目的

掌握细胞内碱性蛋白的鉴别方法并了解碱性

蛋白在细胞内的分布。学会制作血涂片并掌握制作技巧。二、实验原理

由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后用不

同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。三、实验用品1．材料鲫鱼2．试剂carnoy固定液(无水乙醇：氯仿：冰醋酸按6：3：1配制)一次要配制1L.0.1%碱性坚牢绿染液：取0.1g坚牢绿加入100毫升蒸馏

水，再加少量0.1M

NaoH

调节pH至8.0-8.1.5%三氯醋酸70%乙醇香柏油3．器材解剖盘，注射器，载玻片，显微镜,水浴锅等。四、实验方法1．将鲫鱼放入盘中，尾静脉取血,滴一滴血在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。2.

将涂片作好标记放在现配制的Carnoy固定液中固定10分钟，室温晾干。3．放入现配制的5％三氯醋酸中90℃(10-15分钟)，抽提出核酸。4.

将玻片放在70%乙醇中5-10分钟．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。5．滤纸吸干玻片上水分。6.

一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.1)中染色15～20分钟。7．清水冲洗（3分钟），盖上盖片镜检。对照片不进入5％三氯醋酸中抽提出核酸。其他步骤同上。.五、实验中注意事项(1)用5%TCA提取DNA是该实验中的关键。

DNA必须被提取，以使染色质的负电荷下降，用热TCA提取核酸后，酸性染料（固绿）在碱性pH下，碱性蛋白可以选择性地被染色，如未被提取，不能染色，或整个切片染成蓝绿色，水洗或进入酒精即褪色。(2)染液pH必须高（

pH8.0~8.1），从而使其他蛋白质染色极微。六、血涂片的制作１.取一滴鲫鱼新鲜的血液，置于玻片的一端，以左手

拿该片的两端，迅速用右手拿住另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成

４５°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。２.室温下自然晾干。待晾干后进入到Ｃａｒｎｏｙ固定液中进行固定。注意：在制作血涂片的过程中要用力均匀，避免来回推拉及刮片．好的血涂片在显微镜下观察到的细胞应成单层均匀排列。七、相关理论知识１．家畜血涂片。低倍镜下观察可见大量圆形而细小的红细胞。白细胞很少，稀疏地散布于红细胞之间，选白细胞较多的部位（一般在血膜边缘和血膜尾部，因体积大的细胞常在此

出现）

。红细胞:呈圆盘状,边缘厚,中间薄,无核。中性粒细胞:是白细胞中较多的一种,体积比红细胞大,核呈杆状(

为幼稚型,胞核细长,弯曲盘绕成马蹄形,S形,W形或U形等多种形态)或分叶状,一般分3~5叶或更多，跟该细胞年龄有关。淋巴细胞：有大中小三种类型，其中小淋巴细胞最多，血膜上很易看到，体积与红细胞相近．具核，核大而圆．大淋巴细胞在正常细胞中不常见到，体积与单核细胞相近或略小，胞核圆形，胞质较小淋巴细胞多。嗜酸性粒细胞：比中性粒细胞略大，数量少，胞核常分两叶．嗜碱性粒细胞：数量很少体积与嗜酸性粒细胞相近或略小．胞核呈

Ｓ形或双叶状．单核细胞：是白细胞中体积最大的一种，胞核呈肾形，马蹄形或不规则形．细胞质丰富．血小板：体积小，常三五成群散布在红细胞中．２．家禽血涂片．鸡血的有形成分与其他家畜比较有以下不同:１）红细胞，呈椭圆形，中央有一椭圆形的细胞核．２）中性粒细胞，又称嗜性粒细胞，圆形，有2～5个分叶核．３）凝血细胞，又称血栓细胞，相当于其他家畜的血小板；凝血细胞具有典型细胞形态和结构，比红细胞稍小，两端钝圆，核呈椭圆

形．染色质致密．其他细胞与家畜的血细胞相似．人血涂片3.鱼类血涂片１）红细胞，呈椭圆形，中央有一椭圆形的细胞核．２）中性粒细胞，又称嗜性粒细胞，圆形，有2～5个分叶核．３）凝血细胞，又称血栓细胞，相当于其他家畜的血小板；凝血细胞具有典型细胞形态和结构，比红细胞稍小，两端钝圆，核呈椭圆形．染色质致密．其他细胞与家畜的血细胞相似．血栓细胞成熟红细胞鱼血细胞图大淋巴细胞淋巴细胞小淋巴细胞嗜中性粒细胞单核细胞八、实验结果经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色,细胞核大

部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。九、思考题1.细胞内碱性蛋白显示的基本原理?2.制作一张好的血涂片应掌握什么技巧?3.家禽,家畜及鱼类的血细胞有何区别?十、 实验报告要