基因工程及其在医药学中的应用

基因工程及其在医药学中的应用

重组DNA技术DNARecombinationTechnique

2我的课件，讲义，多媒体教程◆基因工程相关概念◆基因工程相关的酶学◆基因工程的载体◆目的基因的制备和分离方法◆载体与目的基因的连接◆重组体的鉴定与分析◆隆基因的表达本章主要内容3我的课件，讲义，多媒体教程重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉4我的课件，讲义，多媒体教程一、重组DNA技术相关概念

克隆(clone)

来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆2.克隆化(cloning)5我的课件，讲义，多媒体教程(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆;(2)细胞克隆；(3)个体克隆（动物或植物）。

技术水平:6我的课件，讲义，多媒体教程7我的课件，讲义，多媒体教程8我的课件，讲义，多媒体教程9我的课件，讲义，多媒体教程

细胞的分化潜能

全能性(totipotency)一个细胞在一定条件下具有发育成完整个体的潜能，称为细胞的全能性(totipotency)。具有这种潜能的细胞称为全能性细胞。10我的课件，讲义，多媒体教程细胞核全能性11我的课件，讲义，多媒体教程12我的课件，讲义，多媒体教程3.DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。

13我的课件，讲义，多媒体教程DNA克隆目的:①分离获得某一感兴趣的基因或DNA;②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。14我的课件，讲义，多媒体教程重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录15我的课件，讲义，多媒体教程（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶ⅠDNA连接酶逆转录酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶16我的课件，讲义，多媒体教程1.限制性核酸内切酶

(restrictionendonuclease,RE)(1)定义识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ17我的课件，讲义，多媒体教程与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。(2)分类、作用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）18我的课件，讲义，多媒体教程第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。(3)命名EcoRⅠ

属种株序Escherichia

coli

RY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶19我的课件，讲义，多媒体教程(4)Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG20我的课件，讲义，多媒体教程BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口21我的课件，讲义，多媒体教程同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ22我的课件，讲义，多媒体教程同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA23我的课件，讲义，多媒体教程合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端2.DNA聚合酶Ⅰ24我的课件，讲义，多媒体教程3.TaqDNA聚合酶

(TagDNApolymerase)是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有５‘→３’聚合酶活性，该酶最适反应温度为75°～80°25我的课件，讲义，多媒体教程合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析4.逆转录酶26我的课件，讲义，多媒体教程(1)具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性.。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等.5.Klenow片段27我的课件，讲义，多媒体教程6.DNA连接酶(DNA

ligase)功能:催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接.28我的课件，讲义，多媒体教程功能:催化多聚核苷酸5´羟基

末端磷酸化，或标记探针.7.多聚核苷酸激酶29我的课件，讲义，多媒体教程功能:在3´羟基末端进行种核

苷酸多聚物加尾8.末端转移酶30我的课件，讲义，多媒体教程（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)31我的课件，讲义，多媒体教程功能:切除5’末端磷酸基团9.碱性磷酸酶32我的课件，讲义，多媒体教程

（三）基因载体(cloningvector)1.概念：携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。33我的课件，讲义，多媒体教程来源分类：质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体载体用途分类：克隆载体表达载体穿梭载体2.常用载体:34我的课件，讲义，多媒体教程克隆载体(cloningvector)能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。表达载体(expressionvector)

使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。35我的课件，讲义，多媒体教程这类载体中含有来源不同的复制子结构，即具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,所以能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达．穿梭载体（shuttlevector)36我的课件，讲义，多媒体教程3.载体具备以下条件:1.具有自我复制能力２．具有多个单一限制性酶切位点３．具有选择性遗传标记４．分子量小，拷贝数高．５．具有较高的遗传稳定性37我的课件，讲义，多媒体教程松弛型的复制子、多克隆位点、筛选标记.

常见:质粒、噬菌体◆克隆载体必需结构:38我的课件，讲义，多媒体教程

具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构．◆表达载体结构特点：39我的课件，讲义，多媒体教程①概念:

存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子。质粒

(plasmid)40我的课件，讲义，多媒体教程◆分子量相对较小，能在细菌内稳定存在◆能在宿主细胞内独立自主复制◆具有某些遗传标志,会赋予宿主细胞一些遗传性状；◆具有多个限制酶的单一位点（多克隆位点）②质粒特点:41我的课件，讲义，多媒体教程42我的课件，讲义，多媒体教程细菌质粒43我的课件，讲义，多媒体教程质粒的复制类型

◆严谨型（strigentplasmid)：复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约１～３份拷贝．44我的课件，讲义，多媒体教程◆松弛型（relaxedplasmid):复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高．基因工程常用载体．45我的课件，讲义，多媒体教程常用质粒载体种类：pBR322pUC46我的课件，讲义，多媒体教程pBR322:人工构建重要质粒优点：具有较小的分子量．具有两种抗生素抗性基因，可作为筛选标记．具有高拷贝数．是松弛型质粒．47我的课件，讲义，多媒体教程目录48我的课件，讲义，多媒体教程pUC质粒特点：１．来源于pBR322质粒的复制起始点２．具有两种抗生素抗性基因，但基因内无核酸内切酶位点３．含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶α-肽段编码基因统称LacZ’基因４．靠近LacZ’基因５‘端有一段多克隆位点，影响LacZ’基因功能49我的课件，讲义，多媒体教程５．含有一个调节LacZ’基因表达的阻遏蛋白基因LacIpUC质粒优点：１．具有更小的分子，更高的拷数２．适于组织化学检测重组体．３．50我的课件，讲义，多媒体教程51我的课件，讲义，多媒体教程噬菌体(phage)

52我的课件，讲义，多媒体教程◆λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）噬菌体(phage)载体系统分类：◆M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列53我的课件，讲义，多媒体教程左臂右臂非必需序列重组分子左臂右臂不能包装的病毒颗粒左臂右臂插入单一酶切位点或一对内切酶位点λ噬菌体DNA改造系统５‘５‘左臂右臂54我的课件，讲义，多媒体教程粘性质粒(cosmid)55我的课件，讲义，多媒体教程

结合质粒克隆载体和λ噬菌体克隆载体的优点．结构：质粒DNA接上λ噬菌体粘性末端(cos).粘性质粒(cosmid)：56我的课件，讲义，多媒体教程◆具有λ噬菌体粘性末端特性◆具有质粒耐药性标记◆具有多个限制性酶切位点◆具有高容量的克隆能力◆接上真核细胞复制子和启动子及选择标记，就能在真核细胞中存在和表达．粘性质粒的特点57我的课件，讲义，多媒体教程酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其它58我的课件，讲义，多媒体教程（四）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)59我的课件，讲义，多媒体教程（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章）

60我的课件，讲义，多媒体教程化学合成获取目的基因61我的课件，讲义，多媒体教程*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列62我的课件，讲义，多媒体教程分子文库63我的课件，讲义，多媒体教程基因组DNA文库获取目的基因(genomicDNAlibrary)64我的课件，讲义，多媒体教程组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录65我的课件，讲义，多媒体教程EcoRIGenomicLibraryInfectcells66我的课件，讲义，多媒体教程限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录67我的课件，讲义，多媒体教程cDNA文库获取目的基因(cDNAlibrary)68我的课件，讲义，多媒体教程mRNAcDNA

双链cDNA

重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体

受体菌

复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录引物69我的课件，讲义，多媒体教程cDNA文库70我的课件，讲义，多媒体教程基于核酸杂交的筛选;基于抗原抗体反应的筛选。在文库中筛选目的基因原理71我的课件，讲义，多媒体教程72我的课件，讲义，多媒体教程

聚合酶链反应获取(polymerasechainreaction,PCR)73我的课件，讲义，多媒体教程5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

PCR基本工作原理目录74我的课件，讲义，多媒体教程Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录75我的课件，讲义，多媒体教程

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C76我的课件，讲义，多媒体教程模板DNA

特异性引物耐热DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分77我的课件，讲义，多媒体教程（五）目的基因与载体的连接78我的课件，讲义，多媒体教程

经限制酶作用于目的基因与载体DNA，在连接酶催化下，来源不同双链DNA片段，断端重新形成３‘，５’－磷酸二酯键的过程．连接原理79我的课件，讲义，多媒体教程

◆粘性末端连接

◆平端连接

◆一端粘性末端与另一端平端连接

连接方式：80我的课件，讲义，多媒体教程方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接81我的课件，讲义，多媒体教程BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录82我的课件，讲义，多媒体教程不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录定向克隆83我的课件，讲义，多媒体教程适用于：限制性内切酶切割产生的平端或粘端补齐或切平形成的平端T4DNA连接酶催化平端连接．

平端连接84我的课件，讲义，多媒体教程目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录85我的课件，讲义，多媒体教程在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。同聚物加尾连接86我的课件，讲义，多媒体教程5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´´5´´T(T)nTT(T)nT5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录87我的课件，讲义，多媒体教程由平端加上新的含有限制性酶切位点的接头，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头(linker)连接88我的课件，讲义，多媒体教程人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录89我的课件，讲义，多媒体教程（六）重组DNA导入受体菌90我的课件，讲义，多媒体教程受体菌条件：◆安全宿主菌◆限制酶和重组酶缺陷◆受体菌处于感受态(competent)

91我的课件，讲义，多媒体教程感受态(competent):指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的改变.经人工处理能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞，称之为人工感受态细胞．92我的课件，讲义，多媒体教程导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)93我的课件，讲义，多媒体教程◆转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.◆转染(transfection):以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.94我的课件，讲义，多媒体教程感染(infection):以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子,经体外包装成具有感染性噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌或真菌细胞,从而使目的基因得以复制的过程.95我的课件，讲义，多媒体教程（七）重组体的筛选96我的课件，讲义，多媒体教程(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹1.直接选择法97我的课件，讲义，多媒体教程

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等３.限制性内切酶图谱４.双脱氧终止法测序（sanger法）98我的课件，讲义，多媒体教程目录(插入失活法)抗药性标记选择99我的课件，讲义，多媒体教程组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录100我的课件，讲义，多媒体教程101我的课件，讲义，多媒体教程102我的课件，讲义，多媒体教程

α互补的检测目录103我的课件，讲义，多媒体教程原位杂交目录核酸杂交104我的课件，讲义，多媒体教程Southern印迹目录105我的课件，讲义，多媒体教程鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录106我的课件，讲义，多媒体教程重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录107我的课件，讲义，多媒体教程

以质粒为载体的DNA

克隆过程108我的课件，讲义，多媒体教程重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因

切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体菌

筛筛选重组体

109我的课件，讲义，多媒体教程（八）克隆基因的表达110我的课件，讲义，多媒体教程

将外源目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞的过程称为外源基因的表达．外源基因的表达外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，111我的课件，讲义，多媒体教程表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化外源基因的表达步骤112我的课件，讲义，多媒体教程外源基因在原核细胞中的表达113我的课件，讲义，多媒体教程原核表达系统就是将克隆的外源基因导入原核细胞，使其在细胞内快速、高效地表达基因产物，主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等．114我的课件，讲义，多媒体教程

E.coli表达体系最为常用组成：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点原核表达体系115我的课件，讲义，多媒体教程表达载体pFASTBACI的物理图谱116我的课件，讲义，多媒体教程◆不宜表达真核基因组DNA◆不能加工表达的真核蛋白质◆表达的蛋白质常形成不溶性包涵体

(inclusionbody)

◆很难表达大量可溶性蛋白E.coli表达体系的不足117我的课件，讲义，多媒体教程外源基因在原核细胞中的表达1．融合型表达蛋白所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行表达．这样产生的蛋白质的N末端为宿主基因序列（可以是原核DNA或其它DNA序列）编码，C末端由外源目的基因编码。118我的课件，讲义，多媒体教程2．非融合型表达蛋白

是指外源目的基因不与宿主基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制之下表达外源基因蛋白质。

非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋白质的结构，其生物学功能也更接近于体内的天然蛋白质。但其缺点是容易被细菌蛋白酶降解。119我的课件，讲义，多媒体教程3．分泌型表达蛋白分泌型表达是利用具有信号肽编码序列的分泌型表达载体，将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞基质或细胞周质中。120我的课件，讲义，多媒体教程

◆强启动子及其调控序列、

◆SD序列

◆SD序列下游携带有一段信号肽序列。常用的信号肽有OmpA、PelB、PhoA和Hly等。分泌型表达载体组成:需注意是，不同蛋白质的分泌需要不同的信号肽，121我的课件，讲义，多媒体教程大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 目录122我的课件，讲义，多媒体教程123我的课件，讲义，多媒体教程外源基因在真核表达124我的课件，讲义，多媒体教程克隆基因含有:原核克隆载体的复制子

抗性筛选基因

限制性内切酶酶切位点序列，

真核表达载体真核表达载体大多是穿梭载体.125我的课件，讲义，多媒体教程

表达基因

真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号PolyA化信号遗传选择标记等组件，126我的课件，讲义，多媒体教程真核表达体系：酵母、昆虫、乳类动物细胞真核表达体系优点：

◆可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰,表达的蛋白质表达产物分区域积累．127我的课件，讲义，多媒体教程◆真核细胞具有翻译后加工系统，可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确的天然构象，具有完整的生物学活性。◆某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌至细胞培养基中，简化了分离纯化的操作。128我的课件，讲义，多媒体教程真核表达体系缺点：操作技术难费时经济129我的课件，讲义，多媒体教程目录130我的课件，讲义，多媒体教程表达载体导入真核细胞方法