RD区EspJ蛋白在结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的作用

RD区EspJ蛋白在结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的作用

刘丽莎钟燕霄田晴刘敏潘勤章晓联罗凤玲(武汉大学基础医学院免疫学系，湖北武汉430071)结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的慢性传染病，是单一传染源的头号死亡原因[1]。世界卫生组织数据显示，2021年全球结核潜伏感染人群接近20亿，新发病例987万[1]。近年来耐药结核病以及人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)和M.tb共感染患者的增多，给我国结核病防治工作带来了更大的挑战[2]。同时，卡介苗(bacillusCalmette-Guérin,BCG)作为当前广泛使用的抗结核疫苗，保护效力存在不足[3]。因此，进一步探索M.tb逃逸免疫杀伤的机制对于结核病的研究、诊断和治疗具有重要意义。1998年，英国Sanger中心和法国Pasteur研究所联合报告了M.tbH37Rv全基因组序列图[4]。通过全基因组比对发现，与M.tbH37Rv或牛分枝杆菌相比，BCG基因组有一部分缺失片段，被称为M.tb的差异区域(regionofdifference,RD)，通称为RD区。RD区共有16个区域，可编码129种蛋白质，与M.tb的毒力密切相关[5]。目前对RD-1区的研究较多，RD-1区蛋白参与了M.tb感染后宿主细胞膜的破坏、免疫逃逸等诸多过程[6]。因此，研究RD区蛋白在结核病免疫中的作用具有重要意义。研究表明，在M.tb感染的过程中，Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)可以调节细胞因子的表达，进而破坏机体对M.tb的免疫反应，有利于M.tb在细胞内的存活[7]。M.tb的强毒力会使白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)依赖型Th1细胞免疫反应降低，从而诱导更高水平的Ⅰ型IFN[8-9]。M.tb的毒力主要是由毒力因子ESAT-6分泌系统1(ESAT-6secretionsystem1,ESX-1)相关蛋白决定[10]。ESX-1基因簇位于RD-1区，参与M.tb宿主逃逸，对M.tb至关重要。EspJ是由Rv3878编码的蛋白，属于ESX-1分泌相关蛋白，目前EspJ在M.tb感染过程中的具体功能尚不清楚。本研究拟通过Rv3878基因原核表达载体，构建表达EspJ的重组耻垢分枝杆菌(MycolicibacteriumSmegmatis,M.s)及重组BCG，探究Rv3878基因编码的EspJ蛋白在结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的作用，以期进一步阐明EspJ的生物学功能，为结核病诊治及新型疫苗研发提供理论依据。1材料及方法1.1菌株和质粒M.tb标准菌株H37Rv[strainATCC(美国模式培养物集存库)25618]和M.s菌株[strainATCC70084]由武汉大学ABSL-Ⅲ实验室提供，并由本实验室冻存。BCG、大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α(strainATCC25922)、E.coliBL-21(strainATCCBAA-1025)由本实验室培养保存。pMV261、pMV361及pGEX-KG质粒由本实验室保存。1.2细胞和动物RAW264.7小鼠巨噬细胞系购自中国典型培养物保藏中心，由本实验室培养保存。BALB/c小鼠，6～8周龄，雌性，购自湖北省疾控中心。本研究已通过我校伦理委员会批准(伦理批号：18021B)。1.3主要试剂1.3.1细菌培养Middlebrook7H9、Middlebrook7H11及MiddlebrookOADC购自BD公司；基因组提取试剂盒与溶菌酶购自TIANGEN公司；ProteinaseK购自Roche公司。1.3.2PCR、RT-qPCR及酶切鉴定质粒提取和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自Omega公司；PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase购自Vazyme公司；EcoRⅠ、HindⅢ购自Promega公司；DNALigationHighKit购自TOYOBO公司。PCR和RT-qPCR引物、DNAmarker均在武汉擎科生物技术有限公司订购。1.3.3蛋白提取及多克隆抗体制备异丙基硫代半乳糖苷(isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)购自Sigma-Aldrich公司；GST-Sephagarose4B购自GE公司。弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich公司；ELISA包被液、TMB显色液购自Biolegend公司。1.3.4蛋白刺激细胞培养基DMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自Natocor公司；polymyxinB购自Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬细胞集落刺激因子购自PeproTech公司；逆转录试剂盒、SYBRGreen均购自TOYOBO公司；TritonX100购自Amresco公司；MouseIFN-βΕLISAKit购自武汉华联科公司。1.3.5WesternBlot十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)、过硫酸铵、吐温-20及无水甲醇购自中国国药集团化学试剂有限公司；聚丙烯酰胺购自Biosharp公司；TEMED购自谷歌生物公司；TrisBase、甘氨酸购自Amresco公司；Marker购自Bio-Rad公司；羊抗鼠IgG-HRP购自ABclonal公司；β-actin单抗购自AffinityBioscience公司；ECL显色底物购自雅酶公司。1.4方法1.4.1PCR1.4.2原核表达质粒构建Rv3878PCR产物和原核表达载体pGEX-KG分别经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，用DNA连接酶连接得到pGEX-KG-Rv3878，转化进E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落培养。提取质粒进行酶切鉴定，并送武汉擎科生物科技有限公司进行DNA基因测序。1.4.3重组蛋白的诱导提取及纯化将pGEX-KG-Rv3878转化进E.coliBL21感受态细胞，挑取单克隆菌落接种于液体培养基(含氨苄霉素)，37℃、200r/min培养至菌液吸光度值达0.6～0.8，加入IPTG，25℃、150r/min培养16h，诱导蛋白表达。碎菌后经高速离心，留取上清和沉淀，并将转化pGEX-KG的E.coliBL21和未经IPTG诱导的重组菌作为对照。上清中加GST-Sephagarosebeads于4℃混匀仪孵育2h。收集柱子后用PBS洗3遍，用Tris-HCL-还原型谷胱甘肽-Elutionbuffer于混匀仪4℃，30min洗脱，得到GST-EspJ并进行鉴定。1.4.4小鼠多克隆抗体的制备取4只6～8周龄雌性BalB/c小鼠，剪尾取100～200μL血清作为免疫前血清对照。针对每只小鼠，取同体积的100～200μg蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化，通过腹腔注射免疫小鼠。每隔7～10天，取同体积的50～100μg蛋白与不完全佐剂混合超声乳化后腹腔注射免疫，共免疫4～5次。眼球取血后可获得多克隆抗体血清，置于-20℃保存。1.4.5ELISA每孔加100μL混合的1～2μgEspJ与ELISA包被液，4℃过夜。PBST洗3次，拍干后每孔加250μL2%BSA置于37℃孵育1h。PBST洗3次，每孔加200μL倍比稀释的多抗血清(1∶200～1∶409600)作为一抗，保留一孔作为空白对照，置于37℃孵育1h。PBST洗5次，每孔加200μLIgG-HRP，置于37℃孵育1h。PBST洗5次，每孔加显色液A、B液各50μL，避光置于37℃孵育10～15min，每孔加50μL硫酸终止。测450nm波长处的吸光度(opticaldensity，OD450)，计算效价。1.4.6重组蛋白GST-EspJ刺激小鼠巨噬细胞将RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bonemarrow-derivedmacrophage，BMDM)接种于六孔板，待细胞密度长至70%～80%，加入5μg/mL和10μg/mL已去除内毒素的GST和GST-EspJ，分别刺激1h、3h、6h、12h。收取细胞，RT-qPCR检测INF-βmRNA表达水平，ELISA和Westernblot检测IFN-β的含量及变化。1.4.7Westernblot将蛋白样品进行SDS电泳，并将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜放入5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1h，用TBS-吐温20[0.5%](TBST)洗涤，加入一抗抗体溶液，4℃孵育过夜。TBST洗3次，加入羊抗鼠或兔IgG-HRP，室温孵育1h。TBST洗3次，滴加显色液后在ECL化学发光仪中显色。1.4.8RT-qPCR提取细胞总RNA，逆转录后得到互补DNA(complementaryDNA,cDNA)，于-20℃储存。RT-qPCR引物序列：鼠IFN-β引物序列为5’-ATGAGTGGTGGTTG-CAGGC-3’(F)和5’-TGACCTTTCAAATGCAGTAGATT-3’(R)；鼠GAPDH引物序列为5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’(F)和5’-ATGCCAGTGAG-CTTCCCGTTCAG-3’(R)；鼠IL-10引物序列为5’-AGTGGAGCAGGTGAAG-AGTG-3’(F)和5’-TTCGGAGAGAGGTACAAACG-3’(R)；鼠IL-1β引物序列为5’-CCCAACTGGTACATCAGCAC-3’(F)和5’-TCTGCTCATTCACGAAA-AGG-3’(R)。RT-qPCR反应体系(20μL)：2×SYBRGREEN10μL，引物(F+R)1μL，ddH2O8μL，cDNA1μL。RT-qPCR程序：Holdingstage：95℃1min，cyclestage:95℃15s，退火58℃20s，延伸72℃20s并收集荧光信号，共40个循环。1.4.9重组耻垢分枝杆菌(rM.s::Rv3878)和重组BCG(rBCG::Rv3878)的构建将Rv3878构建至pMV261和pMV361穿梭载体。在M.s感受态细胞中分别电转化1～5μgpMV261-Rv3878和pMV261，在BCG感受态细胞中分别电转化2～5μgpMV361-Rv3878和pMV361。用卡那霉素抗性的固体培养基分别筛选3天和4周，选择单菌落作为rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878，并进行PCR及WesternBlot鉴定。1.4.10重组菌株刺激小鼠巨噬细胞将RAW264.7和BMDM细胞接种于六孔板，待细胞密度长至70%～80%，加入对数生长期的M.s、rM.s::Rv3878、BCG、rBCG::Rv3878(MOI=10∶1)感染细胞1h后洗去，加入培养基分别培养至3h、6h、12h后收取细胞，RT-qPCR检测IFN-β、IL-1β、IL-10mRNA表达水平。1.5统计学方法各实验均独立重复3次，通过SPSS26.0进行统计学分析，数据采用means±SEM表示，采用t检验进行组间比较分析，P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1Rv3878的原核表达质粒构建及鉴定提取M.tbH37Rv全基因组，通过PCR扩增得到Rv3878基因(图1A)。将Rv3878构建至原核表达载体pGEX-KG，经转化及培养后提取质粒进行酶切鉴定(图1B)及DNA基因测序。酶切结果表明，单克隆1、3号构建成功。DNA基因测序结果显示其与Rv3878基因序列相符。原核表达质粒pGEX-KG-Rv3878构建成功。注：A：Rv3878的PCR扩增；B：pGEX-KG-Rv3878的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。M：DL2000DNAmarker图1Rv3878的原核表达质粒构建及鉴定2.2重组蛋白GST-EspJ的表达及纯化将pGEX-KG-Rv3878转化到E.coliBL21感受态细胞，挑取单克隆菌落培养，加IPTG诱导蛋白的表达。经预实验发现，诱导效果在25℃时最佳。诱导蛋白表达12h后，提取纯化重组蛋白，进行SDS分析鉴定(图2)。结果显示在54kD处有明显条带，表明成功获得GST-EspJ，可用于后续实验。图2GST-EspJ的表达及纯化2.3抗EspJ蛋白鼠多克隆抗体的制备及效价检测用GST-EspJ免疫雌性BALB/c小鼠后收取血清，ELISA测定多克隆抗体效价。结果显示，经GST-EspJ免疫的小鼠能产生针对EspJ的特异性抗体。经预实验确定了稀释浓度，取血清倍比稀释后检测血清OD450。结果显示，随着稀释倍数的增加，其OD450随之下降。免疫后血清OD450/免疫前血清OD450≥2.1时的稀释浓度即为效价，经计算效价为1∶204800(图3)。图3抗EspJ蛋白鼠多克隆抗体的效价检测2.4抗EspJ蛋白鼠血清多克隆抗体特异性验证以GST-EspJ为抗原，多克隆抗体血清为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗，WesternBlot检测多克隆抗体的特异性。结果显示，在54kD处有特异性条带，表明该抗体可特异性识别EspJ(图4)。注：M：marker；1～4：分别为1～4号GST-EspJ蛋白免疫小鼠多克隆抗体图4Westernblot验证抗EspJ蛋白鼠多克隆抗体的特异性2.5GST-EspJ蛋白对小鼠巨噬细胞Ⅰ型干扰素的影响用不同剂量的GST-EspJ刺激RAW264.7细胞，以及相同剂量GST-EspJ刺激巨噬细胞不同时长，RT-qPCR检测IFN-βmRNA表达水平。结果显示，GST-EspJ处理后小鼠巨噬细胞中INF-βmRNA表达水平明显升高，在6h达到峰值，且随着蛋白刺激浓度的增加而升高(图5A和5B)。随后以10μg/mLGST-EspJ刺激RAW264.7细胞，ELISA和Westernblot检测细胞IFN-β的含量变化，发现INF-β表达水平显著升高，在12h达到峰值(图5C和5D)。以上结果证明EspJ蛋白可以促进小鼠巨噬细胞中Ⅰ型IFN的产生。注：A和B分别为5μg/mL和10μg/mLGST及GST-EspJ刺激RAW264.7细胞，RT-qPCR检测IFN-βmRNA表达水平；C和D为10μg/mLGST及GST-EspJ刺激RAW264.7细胞，ELISA和Westernblot检测细胞裂解液中IFN-β的含量及表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P2.6成功构建表达Rv3878基因的rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878将Rv3878基因构建至pMV261、pMV361穿梭载体，酶切鉴定结果显示重组质粒构建成功(图6A和6B)。将重组质粒分别电转化至M.s和BCG中，获得rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878，并进行PCR鉴定(图6C和6D)及WesternBlot鉴定(图6E)。结果显示，菌液PCR产物与Rv3878基因长度相同，rBCG::Rv3878菌株包含Rv3878，并且可表达EspJ。以上结果表明rM.s::Rv3878、rBCG::Rv3878构建成功。注：A：pMV261-Rv3878的酶切鉴定；B：pMV361-Rv3878的酶切鉴定；C：rM.s::Rv3878的PCR鉴定；D：rBCG::Rv3878的PCR鉴定；E：rBCG::Rv3878蛋白表达验证图6表达M.tbRv3878基因的rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878构建和鉴定2.7rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878感染巨噬细胞后可促进Ⅰ型干扰素的产生取对数生长期的rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878感染RAW264.7和BMDM细胞3h、6h和12h(MOI=10∶1)，同时以空载菌株作为阴性对照，RT-qPCR检测细胞IFN-β、IL-1β、IL-10等细胞因子mRNA表达水平。结果表明，rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878可以促进巨噬细胞中IFN-β的产生(图7A和7B)。此外，rBCG::Rv3878感染BMDM细胞后还可促进IL-1β和IL-10的表达(图7C和7D)。注：A：rM.s::Rv3878以MOI=10∶1感染RAW264.7细胞，RT-qPCR检测IFN-βmRNA表达水平；B～D：rBCG::Rv3878以MOI=10∶1感染BMDM细胞，RT-qPCR检测IFN-β、IL-1β、IL-10mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P3讨论结核病是一种慢性传染病，可分为活动性结核病和潜伏性结核病，约5%～10%的潜伏感染个体发展为活动性结核病[1]。在中国，结核病仍然是严重的公共卫生威胁。结核病的早期诊断以及有效的疫苗研发对于结核病防控至关重要。因此，需要进一步研究M.tb感染及免疫逃逸的机制，寻找新的生物标志物和药物及疫苗新靶点。RD区与M.tb的毒力密切相关，有多个免疫优势抗原，一直是M.tb感染机制研究及新疫苗研发热点。关于RD-1区的研究较多，RD-1区全长9.5kb，包含9个阅读框，即Rv3871～Rv3879c。RD-1区是M.tb的主要毒力因子，参与了M.tb感染、免疫逃逸等致病过程[11]。如培养滤液蛋白10(culturefiltrateprotein-10，CFP-10)和ESAT-6是两种免疫优势RD-1区蛋白，可形成毒力决定簇激活免疫应答，参与结核病发病过程[12]。ESAT6分子量低且免疫原性高，在结核病诊断和亚单位疫苗开发方面有重要价值[13]。现已有研究尝试将部分RD-1区基因导入BCG构建重组菌株，可增强疫苗保护性[14]。PE35(Rv3872)、PPE68(Rv3873)蛋白可使巨噬细胞IL-10增加及IL-12降低，参与M.tb的免疫逃逸过程[15]；二者相互作用时结构由无序向有序转变，使M.tb毒力增强[16]。高毒力M.tb感染巨噬细胞时会诱导高水平Ⅰ型IFN的产生。在M.tb感染中，高浓度的Ⅰ型IFN会通过促进免疫抑制分子的产生和降低巨噬细胞对IFN-γ激活的反应等，使细菌在细胞内存活，加重对宿主