实验四 DNA的琼脂糖凝胶电泳

龙志敏20093022012109制药一班实验四DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。2、学习凝胶成像系统的使用。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术，适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段的分离。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此可对分离的DNA进行检测。由于EB具有强致癌作用，现已逐渐改用EB替代染料，如GelRed、SYBRGreen、Goldview等。三、仪器及试剂1、仪器及耗材水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、100mL或250mL锥形瓶、量筒、吸头等2、试剂（1）50×TAE缓冲液(2MTris-乙酸，0.05MEDTA)：称取60.5gTris，用双蒸水搅拌溶解，加入14.3mL冰乙酸和25mL0.5MEDTA(pH8.0)，并定容至250mL，高压灭菌，室温保存。（2）6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油（3）溴化乙啶或EB替代物、低熔点琼脂糖四、操作步骤1、用1×TAE配0.8%琼脂糖凝胶液，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成0.8%琼脂糖凝胶液，加入EB替代染料（每100mL凝胶溶液加染料10μL）。2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，将内槽置于匹配的制胶模具中，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。3、加样：取10μLDNA样品于1.5mL离心管中，加入适量上样缓冲液，混匀（上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×）。用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60~100V，样品由负极向正极方向移动。5、观察照相：结束电泳，取出凝胶模具，将凝胶推到凝胶成像系统的玻璃板上。打开紫外灯下，DNA存在则显示出绿色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。五、常见问题及注意事项1、配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。2、琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。3、琼脂糖凝胶的配制及使用时应带一次性塑料手套，并在实验室专门的实验区域内使用。4、紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。六、思考题结合电泳检测结果（DNA条带的大小和分布）,讨论