植 物 组 培实验报告

实验报告实验名称：烟草植物组织培养班级：姓名：学号：烟草植物组织培养实验目的1、学习植物组织培养技术的基本原理；2、掌握培养基配制方法、步骤及培养环节中，外植体灭菌、接种、培养观察等技术环节；3、了解外植体脱分化及再生过程。实验原理植物细胞全能性（totipotency）指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。2、植物细胞表现出全能性的条件离体状态；有一定的营养物质，激素和其他外界条件（如无菌、温度、pH）；选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型；3、组织培养组织培养(Tissueculture)是指在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织(器官或细胞)的技术。广义的组织培养：包括器官培养，组织培养，胚胎培养，细胞培养，原生质培养，花药培养等；狭义的组织培养是指植物离体快繁技术卸微型繁殖(Mieropropagation)或试管繁殖技术。4、常用的培养基植物组织培养常用培养基为MS基本培养基。凝固剂常用琼脂粉，它最主要的作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水化合物，从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐渐失去凝固能力。5、植物激素（1）培养基中添加的激素是植物激素，是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠等许许多多的生理生化活动。在培养基的各种成分中，植物激素所产生的影响最大。通过对培养物营养需求的研究，可拟定出目标培养物的培养基配方，对植物生理过程的探索，可了解并获得最有成效的植物激素，这两个方面可以认为是植物组织培养不可或缺的二个层面。基本培养基保证培养物的生成与最低的生理活动，只有配合使用适当的植物激素才能诱导细胞的分裂，愈伤组织的生长以及根、芽的分化或胚壮体的发育等。对于培养大多数植物材料来说，选择任何一种常用的基本培养基都能得类似的效果，只有植物激素的种类和浓度搭配合理，才能生长出健壮的植株，这一点要根据瓶中培养物的表现来确定。（2）常用于植物组织培养的植物激素种类主要有生长素、细胞分裂素、赤霉素。生长素的生理作用主要是促进细胞生长和细胞分裂，诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力，形成愈伤组织，促进生根。细胞分裂素的生理作用主要为促进细胞分裂与扩大，可使茎增粗，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长，抑制、延缓衰老，有保鲜的效果。赤霉素(GA)的生理作用主要是诱导芽的细胞伸长。对矮生型植物恢复成高生型特别有效：IAA／GA比值高有利于木质部分化，比值低利于韧皮部分化。实验材料植物材料：烟草叶片2、实验药品：MS培养基（见表.2-1）、蔗糖、琼脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。3.仪器设备：高压灭菌锅、光照培养箱、天平、PH计、超经工作台、酒精灯。4.器械及用具：镊子、手术刀、记号笔等5.玻璃器皿：培养瓶、量筒、容量瓶等。实验步骤1、培养基的选择及母液配制（常用的培养基MS、B5、N6、WPM等）（1）大量元素配成10倍母液，使用时每1L培养基需要从母液中取100ml。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。（2）微量元素配成100倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。（3）铁盐单独配制，与其它元素混合易造成沉淀。一般采用鳌合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大100倍。EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75~80℃之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe2+。有机物质可配成100倍浓缩液，使用时每1000ml培养基加10ml。培养基的配制取1000ml烧杯，先加入500ml的蒸馏水，然后根据培养基成分及用量，吸取各种母液加入烧杯，称取蔗糖（一般用量3%）、琼脂（一般6-8g/L），按需要的浓度加入植物激素，加水至800ml，加热使琼脂融化，定容到1000ml，用1NNaOH或HCl调PH至5.8。培养基灭菌将配好的培养基迅速分装至50ml三角瓶中，用牛皮纸或报纸包扎封口。放入灭菌锅121℃，灭菌20min。4、外植体取材、消毒及接种自大田或温室取材时应选择无病、五虫、生长健壮的外植体。对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用自来水冲净，在70%酒精中浸30s，再加入消毒剂。不同的材料消毒的方式和所需时间不一样，研究者应根据不同材料确定具体消毒方案。外植体的消毒的一般顺序为：外植体----自来水多次冲洗----消毒液处理（75%乙醇30s，消毒液xmin）----无菌水冲洗----无菌滤纸吸干----接种。无菌操作操作前把准备好的接种材料用的培养基、待消毒的材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、70%酒精等放到超净工作台上，然后打开超净工作台和紫外灯，让其运行20min后再进行操作，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的烧杯中，5~10min后取出另一盛有无菌水的烧杯中，无菌水冲洗3~4次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。6、烟草叶片离体培养及植物再生（1）取烟草幼嫩叶片自来水充分洗净，经75%乙醇消毒30s，0.1%HgCl2溶液浸泡8min，无菌水冲洗3-5次后，取叶片近中脉处，切成0.5cm2小块，接种到培养基上（MS+0.5mg/L6-BA，附加3%蔗糖，0.8%琼脂，PH5.8），每瓶接种3-5片。（2）放入光强2000-3000lx，16h/d培养室培养。10d后观察外植体不定芽的再生情况。实验结果与分析丛生芽诱导分化培养：（1）愈伤组织的形成将切成小块的外植体接种于MS培养基上最初植物组织在培养基上，叶片经10d左右叶片边缘伤口处出现少许黄色泡状，泡状形成黄绿色瘤状突起，即为愈伤组织。（如图1）由图片可以看出植物愈伤组织生长较快，经过4天时间愈伤组织体积明显增大（如图2）此时愈伤组织为绿色，表面粗糙，结构松脆。由图1到图2所示的变化可以看出图1此时属于愈伤组织形成过程中的诱导期。外植体细胞大小虽然没有太多的变化，但细胞内合成代谢活跃。经过诱导期以后到图2所示阶段为分裂期，外植体外层细胞开始迅速分裂。短时间内细胞数目成倍增长。随后愈伤组织进入形成期，细胞分裂由原来的局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织，称作组织分生节。（如图3）10月31日10月31日图111月4日11月4日图211月11日11月11日图3（2）愈伤组织再分化经过20天左右愈伤组织开始分化出芽（如图4），并在10天左右的时间内分化出大量的不定芽，但由于培养基内未加入生长素只加入了细胞分裂素6-BA，因此植株仅分化出了芽而未分化出根。由图（5-7）可以看出不定芽生长状况较好，数目较多。总结经过将近1.5个月的植物组织培养实验，成功的将将烟草组织