华南师范大学生命科学学院生物工程下游技术实验报告

华南师范大学生命科学学院生物工程下游技术实验报告实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取姓名：义_忠仁Ricky_学号：指导教师：江学文5实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工上业常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子5

强度发生变化。RNA溶液（pH=）7.0的ε（ρ）=7700-7，RNA的800含磷量为9.5%，含1μg/mL溶液RNA的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度ODnm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简260单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。三、主要仪器和试剂啤酒酵母粉0.04M溶液NaOH95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL。HCl紫外分光光度计离心机真空干燥箱三角瓶、烧杯水浴锅四、实验步骤1、称取2g干酵母粉，用30mL0.04MNaOH溶液分步在研钵中研磨均匀后，转入2支50ml比色管，沸水加浴热45min，冷却，转入离心管，4000r/min，离心15min，将上清慢慢倾入装有10mL酸性乙醇的离心管，边加边搅动。2、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，5000r/min离心5min。弃去上清液。用95％乙醇分步将沉淀转移至布氏漏斗抽滤并洗涤，消耗95％乙醇体积总约30ml；3、再用乙醚洗涤沉淀两次，消耗体积总约20ml，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的4、RNA粗品中RNA纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液：将上述RNA粗品溶解于100ml容量瓶，定容，静置，取上清液重量（减去滤纸重量），并记录该数据。于紫外分光光5

O.D读数过大，度计上测定260nm吸收值，按下式计算纯品RNA浓度。若260则根据O.D再做适当稀释。值260滤纸重m1＝0.32425gRNA粗品重量m2=0.4603g吸光度O.D＝0.100260五、计算：(1)RNA产率抽滤干燥粗品RNA量%2抽滤干燥粗品RNA量抽滤粗品RNA量50%,g;2啤酒酵母，g;(2)纯品RNA浓度（微克/毫升）O.D0.024LV抽滤干燥粗品RNA量260定容抽滤干燥粗品RNA量106O.D260nm吸光度;0.0241微克纯品RNA/毫升吸光度;定容体积,ml；260V定容L比色杯厚度（非壁厚），1；纯品RNA浓度(3)RNA含量%抽滤干燥粗品RNA量抽滤干燥粗品RNA量＝（0.4603－0.32425）×50%＝0.068025gRNA产率＝3.4%纯品RNA浓度＝2.08×10克-4／克干酵母RNA含量＝0.31%六、思考题1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?答：沸水浴的作用主要是破碎酵母细胞，使胞内蛋白质变性，并破坏RNA水解酶活性来保护RNA。由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而RNA存在于5细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。加入NaOH之后水浴煮沸35min的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA则从细胞中分离出来。另外细胞中含有多种分解RNA的酶类（如RNase等），为了避免RNA在提取过程中被降解，得到较为完整的RNA分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解RNA的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护RNA分子的作用。2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？答：因为酵母核酸中含RNA为2.67～10.0%，而DNA含量仅为0.03～0.516％，而且菌体易收集，RNA也易于分离。因此，提取RNA多以酵母为原料。RNA可溶于稀碱溶液，本实验中利用NaOH使细胞壁变性，可以使RNA从酵母中释放出来。RNA的等电点为pH2.0-2.5.3.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖,内层为葡聚糖,中间层为一层蛋白质分子(包括多种酶类)。此外细胞壁上还有少量的脂质和酶。稀碱溶液可以分解膜壁上的脂质，使细胞穿孔。在碱性溶液中，细胞壁上的甘露聚糖和葡萄糖会水解，蛋白质变性，而增加细胞通透性，细胞就会破裂释放RNA。4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?答：核酸均为极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶可溶于10%氯化钠溶液但难溶于50%左右乙醇溶液，所以常用乙醇从溶液中分离沉淀核酸。剂。DNA和RNA5

实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化一．实验目的1、粗酶的制备2、硫酸铵分级沉淀3、透析袋的处理方法和使用二．原理1、盐析原理；2、透析袋脱盐三．实验试剂和器材纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量）14000或7000。四．实验步骤1、将黑曲霉ASP.Niger菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,30.5℃恒温培养72h。2、称取10克发酵麸曲，加100毫升pH5.6的醋酸缓冲液，温度37℃，转速135rpm，摇床摇60min后，用￠15㎝滤纸过滤。3、量取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO422.0克（待加入部分溶解后再加入剩余部分）。4、置冰箱中5℃下静置、沉淀过夜。5、标准曲的线绘制：分别吸取0.1%2.0、4.0、6.0、8.0、10.0别吸取上述溶液各2.5mL置mL，于50mL比色管中，分别定容至25mL。再分于25比mL色管中，各加2.5mL二硝3,5-基水杨酸显色液（DNS试剂），置沸5min（另作1管对照，取2.5mL蒸馏水，加2.5mLDNS试剂，同样煮沸5min）。冷却后，再统一定容至10mL，用721型分光光度计在530nm波长下水浴比色，记录各管的光密度值，以光密度值作纵座标，对应浓度克/毫升，µg/mL）为横座标，绘制标准曲线。五、实验结果（微5

表1各管OD值表组别012345甘露糖含量mg/mL00.020.040.060.080.1OD值00.2940.7181.3031.9342.804绘制标准曲线如下：图1甘露糖标准曲线六、思考题1、（NH）SO沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些？424答：（NH4）2SO4与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1)溶解度大：由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析也要求在低温下进行。硫酸铵在低温时仍有相当高的溶解度，而且远远高于其它盐类。2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。4)价格便宜，废液不污染环境。2、影响盐析的因素有那些？答：影响盐析的因素有以下几点：1)溶液温度：蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。2)pH值：当pH值接近蛋白质的等电点时盐析效率高。3)蛋白质浓度：适当高浓度的蛋白质可提高盐析效率，但过高会发生共沉淀作用。5过低浓度所用盐量较高。4)离子强度：一般说来，离子强度越大，蛋白质溶解度越低。5

实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定一．实验目的1、掌握β-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。。2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D甘露聚糖活力的操作方法。二．基本原理水解含B一1，4甘露糖苷键的甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于半纤维素酶类。B一甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。三、实验试剂和器材721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。pH5.6的醋酸缓冲液四、实验步骤1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在8000rpm，离心10min。收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。（透析袋处理：剪成15㎝长度，沸水浴中煮10min，捞起、扯开，在一端1㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。处理过程中需戴手套！）2、酶液倒入透析袋后，另一端1㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间1.0h，并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！2、透析同时可准备2支50ml的比色管，各加0.25g魔芋精粉，加25mlpH5.6的醋酸缓冲液溶解。操作顺序：先量取25mlpH5.6的醋酸缓冲液加入比色管，在55℃水浴预热，再分次、少量将0.25g魔芋精粉加入，待先加的溶解后再加剩下的！可用竹筷帮助溶解，为免捅破比色管底，切忌用玻棒！溶解完毕，将2支溶有魔芋精粉的50ml比色管始终置于55℃水浴中预热，等8

待酶解。3、将透析好的酶液透析袋置于玻璃漏斗上，剪去上端口一部分，但不要使酶液流出！2支溶有魔芋精粉的50ml比色管，透析好的酶液2ml；另14、1支加灭活的透析酶液2ml（用做对照），将55℃水浴下反支加2管同时置于应10min，取出，放入进行下4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯）冷却，再面操作：（酶液灭活：取5毫升透析酶液置于10ml的比色管，沸水浴15min。）1、事先准备2支25ml的比色管，1支加4.5ml试DNS剂，立即加上述1.5ml2、对照管的酶解反应液；另1支加4.5ml试DNS剂，立即加1.5ml酶解反应灭活酶水解的魔芋精粉管）；3、液（即用2管同时沸水浴5min后，冷却，定容至10ml再,取4ml定容至25ml，于530下nm测定光吸收值。在本实验条件下,定义每min产生1µg还原糖的酶量为一个单位（u）。五、实验结果：OD值＝1.983根据回归方程y=27.893x计-算0.2191得x＝0.101mg/ml=101µg/ml即样品所测吸光度值在标准曲线上的甘露糖B＝101µg/mlV＝15ml测量V＝22ml沉淀六、计算β-D甘露聚糖酶活力8

B10Vn酶活力(u/湿g基）)=110沉淀1.54227B样品所测吸光度值在标准曲线上的甘露糖，g/ml；10测吸光度时比色管的定容体积，ml；V溶解沉淀的体积,ml；（V+2ml5ml）沉淀测量2-水解魔芋精粉消耗的酶液体积，ml；nDNS反应显色液稀释倍数；4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量,g（湿基）；10酶解时间,min;酶活力=10110226.25110=31246.9（u/g湿基）1.52742七、思考题1、透析原理及其作用？原理是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液），其作用是将小浓缩的效果。2、一般所选用透析液的性质如何？在搅拌下，样品液与透析液之比多少较静止状态下过夜进行，样品液与是低离子强度的中性缓冲液，对含有辅基的酶中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。在搅拌下进行透析时，样品液与透析液之比以1：10较好；在静止状态下过夜进行透析时，样品液与液之比以1：20以上为好。答：透析的分子与生物大分子分开，以达到纯化与好？在透析液之比多少较好？答：一般所选用的透析液进行透析时，在透析液透析8实验四柠檬酸结晶提取一、实验目的与要求1、学习钙盐沉淀硫酸转溶提取柠檬酸的方法；2、学习结晶精制柠檬酸的方法。二、原理钙盐沉淀法的原理；碳酸钙（或氢氧化钙）可与发酵液中的柠檬酸发生中和反应，生成难溶性的柠檬酸钙沉淀，柠檬酸钙在80～90度之间溶解度极低，通过过滤（或离心）的方法将其与糖、蛋白质、其他有机酸、无机离子等可溶性杂质分离开。在柠檬酸钙沉淀物中加入稀硫酸在80～85度之间进行酸钙沉淀，硫酸钙在80度左右溶解度极低，趁热过滤（或离心）可将其与柠解反应，生成柠檬酸和硫酸檬酸分离，获得较纯净的柠檬酸酸解液。后续工艺：柠檬酸酸解液再进行脱色、阳离子交换层析除去杂质，最后可以通过结晶法获得纯净的柠檬酸晶体。结晶原理：通过冷却、挥发溶剂等方法使溶液达到过饱和状态时，具有一定形状和大小的固态粒子可从均匀的溶液中析出，称为结晶过程：1、产生晶核；2、晶核成长。过饱和度是这两个过程的推动力。影响晶体质量的因素：法的原理和操作。。结晶1、溶液中杂质少，产品纯度较高；、冷2却结晶时温，度要缓慢降低，防止晶核大量形成，形成粒度不一的晶体；、控3制搅拌速度，结晶初期可搅拌促使晶核产生，晶核成长时降低搅拌速度，防止将长成的晶体打碎。三、主要试剂和仪器中温α﹁淀粉酶；12

发酵液：黑曲霉玉米粉发酵培养基；仪器：旋转薄膜蒸发仪、水浴锅；其它材料：0.1mol/LNaOH2MH2SO4溶液：20％HSO42量取10.8695mL浓硫酸，定容100mL固体碳酸钙粉末。磷酸氢二钾500克（1瓶）硫酸镁·7H2O500克（1瓶）硫酸锰·H2O500克（1瓶）四、实验步骤实验流程碳酸钙硫酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸钙↓硫酸钙↓1、发酵液的过滤200ml取发酵液，置于恒温水浴锅中加热至80~90℃，趁热抽滤（微滤﹖），除去菌体和不溶性杂质。2、碳酸钙中和沉淀根据中和反应式计算碳酸钙加的量，由反应式的物质的量比可计算出中和1g柠檬酸要加0.741g碳酸钙，由此计算出需要加碳酸钙的量将滤液预热至70度，边搅拌变慢速加入计算的碳酸钙（约8g），同时升温，使中和终点时的温度达到85度，保温搅拌20min。（注意;控制好终点，碳酸钙不要过量，量，实验证明，pH达5时，99.8%的柠檬酸已被中和；终点温度不能过低，有利与其他物质分离。）以防产生胶粘性物质沉淀，影响质于柠檬酸趁热过滤，滤饼用沸水洗涤多次。122浓硫酸酸解将中和所得到的沉淀物称重并放入烧杯，加入1倍量的水，调匀，呈糊状，然后再室温下加1MH2SO4（约10％HSO4）酸解，硫酸的加量根据中和是加入碳2酸钙的量来估计;CaCO3+H2SO4——CaSO4+CO2+H2O即100g碳酸钙约加98g硫酸。或者酸解确定硫酸用量。但实际用的量少，因为在洗涤时会有损失。在实际操作中，当加算量的80%时，开始测定酸解终点，也可用精密pH试纸来pH2.0时，完硫酸后，置于90℃水浴保温20min，并不断搅拌。然后趁热过滤，收集清亮棕黄色液体，量体积，并取样测定含量。前分析柠檬酸钙中柠檬酸的含量，以入计初步判断，当即为酸解终点。加操作注意严格控制酸解终点，如果硫酸用量不足，则分解不完全，造成损失。如果硫酸过量，在浓缩过程中，当温度达到70~75℃时，就能使柠檬酸分解，使颜色加深。必须度在85℃以上，才能保证石膏晶体大部分成片状，有利于又可降低石膏在水中的溶解度，增加柠檬酸的纯度。过滤，5、低压浓缩：将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴70～80℃，真空度0.08~0.09MPa，浓缩至原体积约1/10；6、冷却结晶：缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度晶体，称重m克柠檬酸将浓冰箱冷却结晶约36～48h，获得柠檬酸。五、实验结果m＝1.8g计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：m柠檬酸（g）/V发酵液（mL）产率＝1.8/200=9%六、思考题：121、为何要在高温下分离提纯柠檬酸并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀？答：柠檬酸