生物化学王镜岩第三版第五章蛋白质的共价结构课件

第五章蛋白质的共价结构

1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:

primarystructure

一级结构：氨基酸序列

secondarystructure

二级结构：α螺旋，β折叠

tertiarystructure

三级结构：所有原子空间位置

quanternarystructure

四级结构：蛋白质多聚体

1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。

蛋白质的结构层次蛋白质结构层次肽基的C、O和N原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：

限制绕肽键的自由旋转

形成酰胺平面

产生键的平均化

肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体历史上第一个被确定

氨基酸序列的蛋白质

胰岛素

insulin胰岛素的历史第一个生化药物最小的蛋白质，由A链(21AA)和B(30AA)组成；动物胰腺ß细胞分泌的一种激素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；1921年Banting&Best从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，1923年Banting&Macleod获Nobel医学奖；1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；1981年，Berg（因DNA重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素.蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化

2、测定蛋白质分子中多肽链的数目3、亚基分离4、二硫键的拆分与保护5、分析每一多肽链的氨基酸组成6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基7、多种方法的部分水解8、测序9、重叠

10、二硫键位置的确定一级结构测定策略蛋白质一级结构测定步骤N端的测定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应

（sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色)++HF弱碱中氨基酸Sanger试剂(FDNB)标记N末端Sanger试剂标记反应ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E

12345

结论：ABCDEFDNBFDNB完全水解部分水解Sanger试剂标记测序H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高酰化反应氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应

（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+Edman降解法(I)DABITC：有色Edman试剂在Edman试剂上加发色基团Edman降解法1Edman降解法(II)Edman降解法2无冕英雄PehrVictorEdman

瑞典人,1916.4.14-1977.3.191946-47年在美国留学时想到改进1930年Abderhalden&Brockmann发明的

PITC试剂的反应,50年发明Edmandegradation反应.ActaChemScand4:283(1950)

1957年移居墨尔本,远离国际学术中心开始过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度;他坚持不申请专利,给了美国公司得以随便开发仪器的方便.1972年到德国,77年因脑瘤过世.由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测,只有HPLC和相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用该反应测定了RNase的一级结构,遗憾的是Edman没有和他们分享Nobel化学奖.1、肼法2、还原法3、酶降解法C端的测定方法蛋白质与无水肼加热

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

|

|

Rx

Ry

--+--+NH-CH-CONH-NH2

+

NH2-CH-COOH

|

|

Rx

Ry肼(hydrazine)法测定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有机溶剂而被除去多种方法确定肼法C端测定

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)将肽链的氨基酸从N端

(aminopeptidase)或C端

(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，

在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。酶解法末端测序酶解法末端测序肽键的专一性水解(化学法)化学法:CNBr,H+,NH2OH,etc化学法专一性水解消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）泛用酶：

胰蛋白酶（trypsin）；

Lys-X,Arg-X(X≠Pro)

胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;X≠Pro)

嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；

木瓜蛋白酶（papain）；

X-Y(X=R,K,Q,H,Y)

胃蛋白酶（pepsin）；

枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）

专一酶：

Lys-X;X-Lys;Arg-X;Glu-X;X-Asp;Pro-X;Asn-X,商品名：EndoproteinaseAsn-C肽键的专一性水解(酶法)酶法专一性水解太短在多肽链中次序的决定资料：N-末端残基H,C-末端残基S;第一套肽段

第二套肽段OUS

SEOPS

WTOUEOVE

VERLRLA

APSHOWT

HO借助重叠肽确定肽段次序：末端残基HS末端肽段HOWT