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生物化学与分子生物学实验细胞与分子生物学实验教学平台

AKP的提纯及km测定回顾：AKP提取AKP部分纯化AKP进一步纯化AKPKm测定缓冲液I：TrisbufMgcL2PMSFNaN3低渗破膜正丁醇有机试剂差别溶解：降低解电常数；破坏蛋白胶体性离子交换层析DE-52纤维素逐步增加盐离子浓度进行梯度洗脱米曼氏方程式林贝氏双倒数磷酸苯二钠法AKP比活性测定AKP比活性测定关键是维持酶的活性，所以整个纯化过程应维持低温。

比活性测定①蛋白质浓度

紫外分光光度法

考马斯亮蓝法②每毫升样品中的酶活性单位数磷酸苯二钠法

比活性=活性单位/蛋白浓度酶活性测定：磷酸苯二钠法

酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。红色醌类化合物AKP的Km测定：底物浓度对酶促

反应速度的影响TheMichaelis–MentenEquation米氏常数的意义：物理意义：

Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。

Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质有关。

Km反映酶和底物的亲和力，Km值与亲和力愈小。应用：

（1）鉴定酶（2）判断酶的最佳底物：最小Km

（3）计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率（4）测定不同抑制剂对Km的影响Km的测定：Lneweaver-Burke双倒数法

•Lineweaver-Burke

equationrepresentsa

straightlinewithslope=Km/Vmax,Yintercept=1/Vmax，andXintercept=-1/Km•Mostcommonlyused•Goodforobservingenzymeinhibition注意事项：严格反映初速度条件控制反应时间，足够底物浓度控制其它对酶促反应速度有影响的因素

最适酶浓度-先测最适PH、最适温度、不能有抑制剂

整个试

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