MDQ with 32 Karat Softwarec软件操作手册

PAGEPAGE2932KaratTMSoftwarever5.0P/ACEMDQ操作手册贝克曼库尔特有限公司2002年12月15日目录第一章毛细管电泳系统导论第二章P/ACEMDQ毛细管电泳系统组成的概述第三章启动32Karat软件第四章直接控制第五章方法编辑第六章系统运行第七章积分第八章校准第九章定性分析第十章使用迁移率第十一章建立报告特别声明和致谢:1、本操作手册为试用本,有不清楚的地方一律参照英文版原文，并以英文版原文为准。如发现有误之处，请通知贝克曼库尔特公司市场部，以便及时更正，公司市场部将不胜感激！2、贝克曼库尔特公司市场部特别感谢浙江省疾病控制中心任一平教授级高级工程师、福州大学中心实验室有关老师等协助我们完成了大量的工作。特此予以致谢！第一章毛细管电泳仪的导论概述本资料说明毛细管电泳仪的一般原理和以P/ACETMMDQ为主机，带有紫外、二级管阵列和激光诱导荧光检测器的基本操作指导。一般说明P/ACETMMDQ是根据各种电泳的分离机理；在熔融石英玻璃毛细管中进行十七化合物分离的仪器。在P/ACETMMDQ中，在压力、真空或电压的作用下样品进入毛细管后，在高电压的作用下，样品中的各种化合物以不同的淌度通过毛细管。检测这些化合物有两种方法。其一利用化合物对紫外光具有吸收的原理，化合物在毛细管中通过毛细管的窗口，应用紫外或二极管阵列检测器检测起吸收值，将吸收光信号变成电信号传给计算机或积分仪。由计算机制作成电泳图而被分析。第二个方法是利用化合物对特定发射光具有吸收并产生激发光的原理。这里由激光诱导荧光（LIF）来完成。在毛细管中的物质吸收激光诱导荧光检测器所产生的特定波长的发射光，激光诱导荧光检测器在测定、并记录其产生的激发光。再由计算机完成电泳图。P/ACETMMDQ可以分离各种不同的样品，包括：肽类、蛋白、核酸、离子、手性化合物和药物。毛细管电泳比其他分析仪器需要更为少量的样品（5-30微升，进样的量仅仅5-50纳升）。它提供比其他分离技术更为理想的分析手段。电泳基本模式CapillaryZoneElectrophoresis(CZE)毛细管区带电泳毛细管区带电泳也称为自有溶液毛细管电泳，是毛细管电泳中最简单的一种形式。其分离机理是各被分离物质的净电荷与质量之间比值的差异，不同离子按照各自表面电荷密度的差异以不同的速度在电解质中移动，而导致分离。毛细管区带电冰要求缓冲液具有均一性，毛细管内各处具有恒定的电场强度。MicellarElectroPhoresisCapillaryChromatography（MEKC）胶束电动力学毛细管色谱在MECC中，当把离子型表面活性剂加入缓冲液中，并且其浓度足够大时这种表面活性剂的单体就结合在一起，形成一个球体我们称其为胶束。目前，以十二烷基硫酸钠（SDS）使用最为普遍。在MECC的系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相，被分离物在这两个相之间分配，由于它们在胶束中具有保留能力而产生不同的保留时间。和区带电泳一样，缓冲液在管别壁处形成正电，使其显示强烈的向负极移动的电渗流，而SDS胶束由于其外壳带负电性具有向正极迁移的倾向。一般情况下，电渗流的速度大于胶束的迁移速度。因此，迫使胶束最终以较低的速度向负极移动。我们把这个移动的胶束固定相也称之“准固定相”。在胶束电动力学色谱中，中性粒子之间的分离是根据其本身的疏水性的不同而达到的，不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力就大，保留时间就长；反之，保留时间就短。CapillaryGelElectrophoresis（CGE）毛细管凝胶电泳凝胶电泳是用凝胶物质作为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态分散体系，它具有多孔性，具有类似于分子筛的作用。被分离物在通过装入毛细管的凝胶时，按照各自分子的体积大小逐一分离，分子体积大的首先被分离出来，其后是较小的分子。CapillaryIsoelectricFocusing(cIEF)毛细管等点聚焦两性电解质在分离介质中的迁移形成pH梯度，各种具有不同等电点的蛋白质按照这一梯度迁移到它们的等电点的那个位置，并在该点停下，由此产生一条非常窄的聚焦区带，并使不同的蛋白质聚焦在不同的位置上。毛细管等电聚焦的运行过程，可分为三个步骤：A进样。把样品与两性电解质混合并进样。B聚焦。加高电压3－4分钟，使整个毛细管长度范围内建立一个pH梯度，以便让样品在毛细管中向各自的等电点聚焦点移动，形成一条由不同组分排列的带子。C迁移。阴极的缓冲液换成盐类后，再加上电压，使末端引起梯度降低，让已聚焦组分一个一个通过检测器。CapillaryElectrochromatography（CEC）毛细管电色谱在毛细管中装填了液色谱的各种填料；相当于固定相，应用电泳中的EOF电渗流作为动力，电解质相当于流动相。各种小分子、极性或中性化合物在两相之迁移而形成分离。毛细管电色谱尤其适应于小分子（药物）的分离。第二章P/ACEMDQ毛细管电泳系统组成的概述P/ACEMDQ毛细管电泳系统的主要组成部分有:放置样品瓶、缓冲液和其它溶液的盛盘、系统连接装置、电极和高压电源、检测器和连接光纤、温度控制装置以及自动进样装置等。各个部件的详细配置情况见图1。图1P/ACEMDQ仪器的主要部件图解图2样品盘示意图图3图示毛细管卡盒备注：1、内可容纳毛细管的制冷剂管道2、毛细管3、UV和PDA检测窗口4、LIF检测窗口图4指示灯的位置备注：1、高压指示灯2、UV灯亮指示灯3、仪器电源指示灯图5图示样品盘和卡盒盖板备注：1、样品盘盖板2、卡盒盖板图6UV检测器光纤的连接方式示意图图7PDA检测器光纤的连接方式示意图图8带LIF检测器的P/ACEMDQ仪器示意图图9LIF检测器的光学系统图解图10488nm激光光源大背面观第三章启动32Karat软件从Windows工具条上开始菜单按钮选择Programs/32Karat/32KaratSoftware启动32Karat软件.图1132Karat软件在开始菜单的位置32Karat软件启动后打开列出已设置的仪器的主窗口.图1232Karat软件的主窗口工具条工具条在顶部出现并且,在一些情况下位于当前的窗口底部。在工具条上的活跃按钮允许以鼠标单击的方式达打开许多普通的命令。以上这些按钮可在打开的窗口中看到。菜单条菜单条包含32Karat软件可得到的所有命令。菜单条能通过鼠标单击或按住Alt键和带下划线的字母打开。新建并且设置一台仪器在这练习中你将：新建一台真实连接的仪器新建一个能被用于离线数据处理的虚拟仪器注意这章假设所有的硬件和接口板都已安装，如果没有安装，请先参考安装和维护手册进行安装。新建一台仪器从一台单个的计算机用32Karat软件最多能控制4台P/ACEMDQ能创建无数的虚拟仪器用于离线编辑方法或数据分析。使用下列练习设置一台新机器。选择和你的硬件配置相对应的检测器类型。1、在右边的空白处单击鼠标右键，从下落菜单选择New/Instrument。2、一台新仪器将建成，它的图标位于右边的空白处。在加亮的名称域输入仪器的名称（在这个例子我们将它命名为Instrument1），这个名字将在整个32Karat软件中使用，在仪器窗口，数据报告，和仪器记录。图1332Karat软件打开窗口设置新仪器设置仪器是软件准备控制硬件和采集数据的过程，包括：1、识别P/ACEMDQ为唯一的仪器。2、识别当前的硬件部件。每台物理的仪器至少由2个图标代表其中之一将被用于控制和数据采集；在第一个正在用于采集数据时另一个被用于数据的离线处理。下面将以UV检测器为例。1、在Instrument1图标上单击鼠标右键，从下落菜单选择Configure。2、在Instrumenttype下拉选框中选择BeckmanP/ACEMDQ；输入名称Instrument1标识仪器。3、单击Configure按钮，在BeckmanP/ACEMDQ设置窗口可用的模块出现在窗口的左面。自动设置32Karat软件可自动设置所有的P/ACEMDQ模块。注意要将仪器电源打开并连接到电脑上。1、单击窗口底部的AutoConfiguration按钮，可听到MDQ的托盘移动的声音，这表明软件正和仪器通讯。在这一过程中会出现以下窗口。2、检测器将在已设置的模块窗口中出现。3、在新图标上单击鼠标右键并选择Open。核对仪器被正确的检测和设置。图14P/ACEMDQUV检测器配置窗口4、和计算机相联的每一台P／ACEMDQ必须有唯一的设备ID、设定的缺省植是l。如果安装有多台的MDQ，为每一台MDQ选择唯一的ID（l，2，3或4）在选择好ID后点击SETBUSADDRESS将该信息传送给仪器。5、缓冲液托盘和样品托盘的类型在开始时被检测。托盘盖子被打开并且关上后每次都会检测托盘的类型。仪器能自动检测3种类型的托盘：36位缓冲液托盘，大容量缓冲液托盘和48位置样品托盘。96孔样品极不能被自动检测，必须从该窗口手动设置。托盘类型可以手工地在任何时间被改变。6、当选择96孔样品板时，允许定义样品板的复选框可用，如果这个复选框被选择，用户可以定义样品板的高度和深度，因此可以使用其他的非标准样品板。如果这个复选框没被选择，仅能使用标准的BeckmanCoulter96孔样品板。7、如果安装了LIF检测器，LIF校准向导可用。这个功能在安装和维护手册中有详细的描述。8、滤光片对话框用来定义UV检测器安装的特定滤光片。数据必须手工输入并且和仪器实际安装的滤光片—一对应。如果安装了PDA检测器，位置8不能安装滤光片，显示值为“0”。9、压力单位可定义为psi（磅每平方英寸）或mbar（毫巴）。选择的单位将仅仅在这台仪器被使用。10、温度控制显示样品冷却装置的安装。如果安装，可从下拉框选择“可用”。11、单击 OK回到仪器配置窗口。图15BeckmanP/ACEMDQ仪器配置窗口配置选项图16P/ACEMDQ配置选项对话框（分析选项）分析选项定义重新处理数据时采用的软件功能。PDA允许分析PDA检测器的多通道数据。SystemSuitability可自动查看结果。未选择的结果可实时更新。QualitativeAnalysis允许以迁移时间，相对迁移时间或迁移率。CaesarIntegration用于检测峰的开始和结束。当基线突然跃迁或信噪比较低时非常有用。如果未选择，峰的开始和结束基于斜率阀值。仪器选项图17P/ACEMDQ仪器设置选项对话框（仪器选项）StandardCE峰达到检测器窗口的时间称为迁移时间。CEC/LC峰到达检测器窗口的时间称为保留时间。这一选择会在谱图和报告中反应。12、单击OK退出并且保存模块设置。13、单击OK回到开始菜单。手动设置手动设置UV检测器手动设置用于仪器关机或正在使用时。注意在该手册中的许多练习需要设置一台虚拟的UV检测器仪器。按照以下过程建立一台虚拟的UV检测器仪器，不考虑实际的仪器配置。1、在主菜单新建一台设备，并命名为“UVformanual”。2、在这一练习中设置UV检测器。选择左边的UV检测器图标，单击图标，新加一台UV检测器仪器。3、在新图标上单击鼠标右键并且选择Open，出现P/ACEMDQ设备设置对话框。4、选择仪器使用的托盘。5、点击OK退出并保存模块配置。配置选项关于配置选项请参看以上内容。手动设置PDA和LIF检测器参照UV检测器的设置，注意每台设备只能有一个检测器。第四章直接控制简介直接控制屏幕相当于仪器的面板操作。可以对仪器的操作参数进行既时修改，直接控制对操作准备、维修保养和故障排除非常有用。在直接控制界面通过用鼠标点击相应的区域来控制仪器。并且可以看到仪器的现时状态。DirectControlWindow直接控制窗口点击Control下拉菜单选择DirectControlView，打开直接控制窗口。图18直接控制窗口中的特殊区域1、毛细管温度2、托盘上/下3、标签对话框4、托盘上/下5、灯开关6、检测器对话框7、调零8、托盘回到原始位置9、托盘到装载位置10、进样对话框11、停止当前步骤12、样品存储温度13、电压对话框14、电流对话框15、功率对话框16、压力对话框17、瓶位置对话框。以上是UV检测器的直接控制。PDA和LIF检测器大致与此相同。表1直接控制的功能直接控制中的功能温度毛细管温度热点击打开对话框设定制冷液温度样品温度热点击打开对话框设定样品存储温度托盘上/下热点击将托盘上下移动瓶位置热点击打开对话框将选择的瓶子移到毛细管末端装载按钮将托盘移到装载位置回到原始位置按钮将托盘移到原始位置光学系统检测器控制热点击打开检测器的对话框灯/激光状态热点击打开对话框可将灯/激光打开或关闭调零按钮将检测器输出调零动力控制电压按钮打开对话框设定电压分离参数电流按钮打开对话框设定电流分离参数功率按钮打开对话框设定功率分离参数压力按钮打开对话框设定压力分离参数其它控制进样按钮打开对话框设定进样参数停止按钮停止仪器操作毛细管信息热点击打开对话框输入毛细管和卡盘的信息表2状态显示在直接控制中显示的状态状态文字显示当前仪器的功能和状态剩余时间文字/示意图显示当前仪器操作的剩余时间托盘位置文字/示意图显示毛细管末端的位置卡盘状态示意图显示是否安装卡盘盖子状态示意图显示盖子关闭或打开卡盘温度文字/示意图热点击显示当前制冷液的温度样品存储温度文字显示当前样品存储的温度样品存储状态示意图显示是否安装样品温度控制装置灯/激光状态示意图/热点击显示灯/激光灯打开或关闭电压文字/示意图/按钮显示当前、设置和最大电压电流文字/示意图/按钮显示当前、设置和最大电流功率文字/示意图/按钮显示当前、设置和最大功率压力文字/示意图/按钮显示当前、设置和最大压力压力类型/示意图显示压力或真空、和毛细管抹端的位置极性示意图显示电极的+和-极性检测器信号文字/热点击检测器的实时信号毛细管信息文字/热点击显示毛细管信息练习：处理新的石英毛细管。注意该过程不能用于涂布毛细管。所需物品：l、已安装好的卡盘，（75umI．D．60cm总长，到检测器长度为50cm的石英毛细管。）2、甲醇（HPLC级）3、0.1mol／L盐酸水溶液4、毛细管再生液A（lmol／L氢氧化钠水溶液）5、运行缓冲液A（P／N338426）6、重蒸水7、2mL缓冲液小瓶8、36位缓冲液托盘按下表所示按倾序放置各种溶液，注意照安装维护手册进行。表3瓶子放置的位置溶液左边缓冲液托盘（Inlet）右边缓冲液托盘（Outlet）甲醇B10.1mol/L盐酸C1再生液A(P/N338424)D1重蒸水E1运行缓冲液AA1A1空瓶B1检查卡盘和样品托盘正确安装。关好托盘盖，注意直接控制图象屏幕上是否显示卡盘和托盘该已安装好。此时应能听到制冷剂开始循环的声音。在直接控制屏幕上点击压力区域，出现图19的对话框。图19压力对话框该对话框用于设置冲洗和压力分离的参数。Pressure：输入所需压力，正向压力范围为：0.1-100psi；真空范围：0.1-5psi。Duration：持续时间，单位分钟。Direction：方向，正向（从毛细管进口到出口）或反向（从出口到进口）PressureType：压力类型，使用压力或真空(但一般使用压力).TrayPositions：指明毛细管冲洗瓶位置。点击Trays按钮，打开瓶选择对话框，见图20。可以直接点去相应的位置，例如分别选择左边的B1和右边的B1即选择甲醇和空瓶，点击OK后回到压力设置对话框。瓶位置示意图应显示Inlet：BI：B1和Outlet：BO：B1。在Pressure框中输入20，在Duration框中输入1.0，Direction为正向，PressureType为压力。对话框上如同像图19。点击OK。瓶子移到指定的位置，开始冲洗。按照表4的步骤进行其它步骤的冲洗。图20选择瓶位置对话框表4冲洗步骤溶液InletOutletPressureTime甲醇B1B1251重蒸水E1B1250.50.1mol/L盐酸C1B1202重蒸水E1B1200.5再生液AD1B1202重蒸水E1B1200.5运行缓冲液AA1B1202当冲洗完成后，新毛细管已处理好。毛细管中充满运行缓冲液，下一步将进行电压设置。电击电压区域打开下面的对话框。图21电压设置对话框该对话框用于设置电压分离参数。参数如下：Voltage：分高电压0.1-30千伏Duration：运行电压的时间0.1-999.9分钟RampTime：达到目的电压所需的时间0.1-999.9分钟。VoltageMax：系统允许达到的最高限定电压，应高于或等于分离电压。CurrentMax：系统允许达到的最大限定电流。TrayPositions：运行时瓶子的位置，与压力冲洗时瓶子位置的设置万法相问。WithPressure：允许在使用电压运行的同时使用压力；如果选中，还需设定压力值和方向。压力最大值为100psi，压力可加在进口（正向），出口（反向）或两端同时加压。Withvacuum：允许在使用电压运行的同时使用真空，如果选中；还需设定真空值和方向。真空最大值为spsi，压力可加在进。端（正向），或者出口端（反向）但不能两端同时加真空。ExternalAdapter：如果使用外部设备必须选中该项。详情请参看安装维护手册。Polarity：选择电极极性，注意看示意图。在这一练习中选择运行电压的瓶子为运行缓冲液A系统，即Inlet：BI：Al和Outlet：BO：A1。其它参数如下：Voltage：30kVDuration：2minutesRamptime：0.5minutes点击OK，瓶子移到指定的位置开始加电压。请注意电压、电流和功率的变化。电压为30KV时电流一般在27－33微安。2分钟后电压回到零，仪器回到空闲状态。至此已完成直接控制练习，在进行下一练习前请先熟悉直接控制中的各个功能。第五章方法编辑新建一个方法简介在直接控制练习中，再生毛细管的每一个步骤都需要单独输入参数，方法可将每一个步骤合并成合理的连续过程，仪器能按此程序完成一系列的步骤。本章将描述建立采集数据方法的最基本步骤。还有其它的功能如数据分析、报告打印也是和方法整合在一起的，这将在以后的章节中作详细描述。建立或编辑方法必须进入仪器窗口，先进入32Karat主窗口，用鼠标右键单击所建立的仪器，选择OpenOffline。几秒钟后会打开仪器离机窗口，同时打开仪器向导。可以从向导中选择CreateorModifyaMethod打开方法编辑对话框。现在点击OK关闭向导。下面将新建一个方法运行测试标样。从文件菜单选择FileMethodNew仪器菜单标题栏上的方法名变为“untitled.met．”在方法菜单选择MethodInstrumentSetup进入方法的仪器控制和数据采集模块。随着不同检测器将会出现有3－4个选项卡的窗口。选择其中一个为“InitialCondition”（初始条件）的选项卡，进入初始条件对话框。在这个对话框中可输入用于仪器开始方法运行时的参数。InitialConditionTab初始条件表在先前的一节，直接控制，需要练习者分步输入每一步动作。在本节中把每一步结合成一个系统逻辑操作过程，此称为一个方法的。在这个方法中的各步骤是通过仪器自动进行的。本节描述的仅是建立一个为了仪器能采集数据的基本方法。有关更多的功能，诸如：数据分析、形成报告等均可编入一个方法，其中部分将在以后章节中说明。对于更多的说明可参考附录3。在本练习中需要编写一个用于运行标准试验样品的新方法。从菜单选择FileMethodNew。要想进入方法的仪器控制核数据采集部分，从某单选择MethodInstrumentSetup。出现一个随着不同检测器将会出现有3－4个选项卡的窗口。选择“InitialConditions”出现如同图22的对话框。在这一框中设定方法开始运行时的仪器初始参数。图22仪器设定对话框—初始条件表Auxiliarydatachannels辅助数据通道在32Karat软件中可以选择采集多个仪器参数：电压、电流、功率和压力。在你想选择的参数前打勾。MaxkV和maxuA框中输入最大允许的电压和电流值。只要其中一个参数达到限制值；系统将自动进行保护。Mobilitychannels迁移率通道这一选项将在后面详细说明。Temperature温度设置卡盘温度初始和样品温度（如果安装样品冷却装置后），该参数可以在时间程序中加以改变。Peakdetectnarametcrs峰检测参数这一参数用于触发其他事件，例如馏分收集。并不用于峰的积分和数据分析。Triggersettings触发设置P／ACEMDQ可等待仪器参数与设定参数一致时才开始运行。如果选择“waitforexternaltrigger”则MDQ须等待外部设备的信号，其余两个Waitfortemperature”指系统要达到设定的温度。这些选项只会延迟时间程序的运行，不会影响初始条件。InletandOutlettrays方法使用的托盘类型，如果和仪器配置中的设置不一致，方法不会运行。DetectorInitialConditions检测器初始条件在这次练习中比较图22所示选择检测器初始参数。注意下一个表用于设置在你仪器中所连接检测器的初始参数。UVDetectorInitialConditions紫外检测器的初始条件点去UVDetectorInitialConditions参数表。图23选择检测器初始参数表ElectroPherogramchannel电泳通道选中Acquisitionenabled才能采集并保存数据。Wavelength框可选择仪器设置时设定时设定的滤光片，Datarate可选0.5－32HZ（点每秒），窄峰所需的采集速率越高。Filter滤波滤波指用不同的算法对采集的数据进行处理，和滤光片不同，主要用于过滤干扰数据分析的外来噪音。Highsensitivity应用于高灵敏度但会损失分辨率；而HighResolution应用于高分辨率但会损失灵敏度；Normal用于一般的分析,可兼顾灵敏度和分辨率。滤波选择时需要知道每个峰组成的点数,最佳的点数为16-25，同时也存在“lessthan16”和”morethan25”的选项。可以调节采集速率使典型的峰有I6-25点，使滤波效果达到最佳。Relayl和Relay2P/ACEMDQ的两个继电器接口可以控制和触发外部设备，这个对话框用于设定方法开始时的状态，这些状态也可在时间程序中设定。其他详细的情况请参看安装维护手册。AbsorbanceSignal吸收信号这个参数有两个选择，Direct和Indirect。当分析物比背景电解质有更高的吸收时选Direct（直接）；当分析物比背景电解质的吸收低时选Indirect（间接），这样能同样得到向上的峰。在这一练习中按图23所示设置UV检测器的初始参数。PDADetectorInitialConditions二极管阵列检测器初始参数图24仪器设置—PDA检测器初始参数ElectropherogramScanData扫描数据这一部分控制三维数据（3D）的采集。如果需要采集3D数据则必须选中Acquisitionenabled，Datarate可选择0.5到32Hz，窄峰所需的采集速率要高，采集速率高则数据量也大。Scanrange的范围从190-600。Filter滤波参照UV检测器的设定。RelaylandRelay2参照UV检测器的设定。ReferenceChannel参照附录的说明AbsorbanceSignal参照UV检测器的设定。ElectropherogramChannelData在采集3D数据的同时最多能再采集三个独立通道的数据。必须输入以下参数。Acquisitionenabled：可采集数据Referencechannel：参比通道Wavelength：波长Bandwidth：谱带宽，数值大则信噪比增加，数字小则选择性增加。Peakdetect：峰检测在这一练习中按图24设定PDA检测器初始参数Multi－Egram：图25仪器设定—多通道图谱表允许采集和3D数据独立的多通道数据。详细说明请参考英文使用手册附录。LIFDetectorInitialConditions激光诱导荧光检测器初始参数设定图26仪器设定-LIF检测器初始参数ElectropherogramChannel1and2LIF检测器可同时使用一个或两个采集通道。当有非贝克曼的激光源时可使用其中的一个通道。在我们的练习中只使用一个通道。Acquisitionenabled允许采集数据。Dynamicrange设定信号的范围。高的设定值使响应高的信号不会出现平头峰，但会损失灵敏度，小的设定值正好相反。默认值是100。Signal信号。在非荧光背景电解质中分离荧光物质时选择Direct（直接）；在荧光背景电解质中分离非荧光物质时选择Indirect（间接）。DataRate采集数据的频率，两个通道必须一致。Relay1and2继电器1和2。在这一练习中LIF检测器的参数和图26一致。TimeProgram时间程序图27仪器设定—时间程序表时间程序窗象电子表格，每一行是一个事件，每个事件按预序执行。每一行有以下几列组成。Time：事件发生的时间Event：进行的动作Value：值的设定和动作相关Duration：动作延续的时间InletandOutletVial：事件过程中毛细管两端的位置。Summary：系统对事件的描述Comments：使用者对事件的描述时间不是必需的参数。无时间限制的事件按从上往下的顺序执行，上一事件执行完毕后再执行下一事件。有时间限制的事件按时间质序执行，但无时间限制的事件必须在有时刻的事件前进行，数据采集在0.00时刻开始，直到STOPDATA事件执行。点击EVENT框的图标打开事件选择列表。图28事件选择列表以下将描述练习中所选择的事件，其他信息请看附录。Separate分离对话框设定分离参数，每个方法必须有一个分离事件。一般在0.00时刻发生。图29分离对话框需要设定以下参数SeparationType：电泳分离可控制电压、电流或功率恒定。电压和电流不能超过初始条件中设定的限制。分离可用气压或真空，也可在使用电压、电流或功率时加气压或真空。Polarity：决定电流方向。可按所示选择电流的正反向。Values：参数值，选择的分离类型不同；要求输入的参数也不同。Ramptime只用于电场分离，指电压、电流或功率从当前值到设定值的变化时间。Traypositions：瓶子位置可点击Trays（托盘）按纽进入位置对活框选择，也可直接输入。图30选择瓶子位置对话框。PressureDirection：是否使用压力或真空。压力可在两端同时加，真空只能加在其中任意一端。AtTime：决定是否为有时间限制的事件，分离事件一般为有时间限制的事件。ExternalAdapter：改变仪器控制高压电源的方式，只有在使用外部接口时才使用此项，详细情况请参看安装维护手册。Rinse冲洗事件用于清洗毛细管、加载缓冲液和分离介质。图31冲洗对话框包含以下参数：PressureType：选择冲洗方式TrayPositions：和分离事件中的功能相同Values：冲洗强度参数（压力和时间）PressureDirection：压力或真空的方向AtTime：参看分离事件中的描述。Inject：进样事件用于加载样品，一般为在分离事件之前的无时间限制的事件。图32进样对话框包含以下参数：InjectionType：可以采用压力、真空或电动进样Polarity：电进样时电极的电流方向PressureDirection：压力和真空的加载方向Values：进样的强度（压力和时间）TrayPositions：参看分离事件中的描述SequenceTable：如果用序列表，选中该项可以在序列表中修改进样参数。可以使用多次进样。Autozero图33自动调零对话框将检测器的输出调零，限制时间可有可无。StopData图34停止数据对话框数据采集从0.00分钟开始，一直到StopData事件发生。这是一个有限制时间的事件。End图35结束对话框结束事件是有限制时间的事件。按照以下步骤建立时间程序。该程序包括：．多溶液再生毛细管．装载缓冲液．进样．分离．运行后冲洗所需的试剂和摆放位置见下表表5溶液左边缓冲液托盘右边缓冲液托盘标样C1再生液D1重蒸水E1运行缓冲液AA1，A2A1空瓶B1点击时间程序表，点击事件框和向下箭，从下拉菜单选择Rinse，点击Trays按钮，选择进口（左）为D1，出口（右）为B1，点击OK回到冲洗对话框，使用默认的参数并点击OK回到时间程序表。主要的参数已自动输入到表格中，这是无限制时间的事件，所以时刻窗口中没有值。在下一行建立新的冲洗事件，选择从BI：E1到BO：B1；持续时间为0.5分钟。再建立一行冲洗事件加载缓冲液，选择从BI：A1到BO：B1，压力为25psi，持续1分钟。点击事件栏，选择进样事件。进样从BI：C1到BO：A1，压力为0.4psi，时间为3秒。下面可进入分离事件。点击事件栏选择Separate事件。位置为BI：A2和BO：A1；选择电压分离；电压为30KV，ramptime为0.2分钟，持续时间为6分钟。选中Attime按钮，设定时刻为0.00分钟。点击OK回到时间程序表。在时间程序中有后冲洗步骤，固此需要StopData事件。点击事件栏选择StopData，在时刻中输入6.00；使采集数据在6分钟的时候停止。最后一个事件是冲洗。从BI：E1到BO：B1，压力为20psi，持续1分钟，在6分钟时开始。可以在分离事件开始以后进行调零事件，在新的事件栏选择Autozero，时间为1.00。在输入完成后它会自动移到正确的时间位置。到此，时间程序设置如图36。图36仪器设置—时间程序仪器设置的参数可进行修改，只要鼠标点击响应的区域就可实现。重要的是：参数设置完成后要保存你所编辑的方法。选择FILE/METHOD/SAVEAS，并按给方法予命名。默认的目录路径是d：\32Karat\Projects\Default\Methods。方法现在已可以运行了。第六章系统运行SingleRun单个运行在上一节中我们建立了一个仪器方法，在这个练习中我们将以单独运行的模式运行方法。在这个模式下；方法必须手工地被用户在每次运行前启动。单个运行的模式在方法建立中是有用的。可根据运行的结果对方法或另外的过程进行修正。在这节的第二部分我们将创建序列做多个样品的运行。必须在联机的状态下进行样品运行和数据采集。如果不是联机的，会在仪器窗口的标题栏出现“（Offline）”。在继续前关闭任何离机的窗户。从32Karat软件的主屏幕，双击仪器图标进入联机状态。注意检测器的光源或激光光源必须在开始一个方法运行以前打开。灯或激光光源的状态可从直接控制屏幕看到。UV灯可以在那里打开。如果激光光源部件的电源开关已经打开，并且所有的安全联锁已经关闭，激光光源可以从直接控制屏幕打开。所需材料：在直接的控制练习中准备的毛细管卡盘，毛细管规格为直径75urn，总长度为60cm（到检测器的长度为50cm）。（请参看安装和维护手册关于新装卡盘和毛细管的介绍。）．毛细管再生液A（1M氢氧化钠P／N338424）．运行缓冲液A（P/N338426）．重蒸水（HPLC级）．2mL小瓶和红瓶塞．36位缓冲液托盘．UV或PDA检测器：混合标样B（P/N501333）．LIF488nrn氩离子激光：LIF检测器混合标样（P／N477615）．LIF635nrn半导体激光：LIF检测器混合标样（P/N726022）按下表放置试剂：表6溶液左边缓冲液托盘右边缓冲液托盘标样C1再生液D1重蒸水E1运行缓冲液AA1，A2A1空瓶B1从菜单选择Control/SingleRun或点击图标打开单个运行对话框：图37单个运行采集对话框你必须提供：SampleID,Method和Datafile。数据文件将保存在数据路径指定的目录下。SampleID用于内部标识样品。这个标识将在以后的报告中出现。可以点击打开图标选择正确的方法。在本统习中选择方法编辑中建立的方法。数据路径和方法的选择一样；不过选择的是文件夹而不是文件。数据文件可在方框中直接输入。但不能与数据路径中的文件重名，如果这样，方法将不会运行。其它的项目在方法运行中无需输入。至此点去Start；系统会先检查方法是否和仪器设置相符，然后将方法传输到P／ACEMDQ主机，经仪器自检，然后再执行方法。如果方法不能被执行，或是所得谱图和范例中不一致时，请检查以下几点：．·缓冲液瓶中的液体是否正确。．·缓冲液小瓶的位置是否和方法一致。．·选择的方法是否正确。．·方法和仪器设置是否一致．·方法是否正确．·托盘的设置是否一致这一方法将用于以后的其它练习，请在得到正确的结果后再进行后面的练习。ProgrammingaSequence设计一个序列应用序列表可以自动运行成批的样品,能用于采集数据和数据处理。在这一练习中将建立序列采集多次的数据。必须在“online”状态下进行。建立新的序列，从仪器窗口选择File/Sequence/New，打开序列向导，共有5个屏幕，不同的序列会用到不同的屏幕，这一练习不需要用到所有的细节。图38序列向导—方法对话框第一屏幕需要选择方法，点击图标找到在上一练习中建立的方法。由Datafiletype中选择Foracquisition，点击Next。图39序列向导—未知样品对话框这一屏幕需要输入SampleID和DataFileID。在SampleID栏中直接输入文本信息，点击右边的蓝色箭头会打开下面的菜单。图40样品ID选项菜单选择其中的一项会在SampleID栏中插入栏中符号，在这一练习中选择LineNumber，该参数会在序列表中自动加入。DataPath点击图标指定数据文件存放的位置。在DataFile栏中输入数据文件名，点击右边的蓝色箭头会打开下面的菜单。图41数据文件选项菜单如同上面样品ID选项菜单中的描述一样，选中的参数会加在DateFile栏中。在这一练习中选择DateandTime。NumberofUnknownRunsinSequence序列表中的行数，输入3。RepetitionsperRun每一行重复运行的次数。系统会在教据文件名加入重复标识。在这一练习输入1。图42序列向导—瓶位置对话框如果在方法中选择允许改变瓶子位置，可以输入起始的位置。如果未选择或选择自动增加，可以忽略。系列的校准样品位置也可以输入。关于校准信息的细节请参看附录l。图43序列向导—标准对话框这一练习不需要输入校准信息，点击Next继续。图44序列向导—报告对话框可以选择在序列完成后自动进行的报告，这一练习不需要选择。点击Finish出现新建的序列表。图45序列表这一屏幕有许多列组成，大部分的信息都能修改。并不是所有的列都会在本练习中使用，其中的几个要点如下：RunType：由于我们选择了SummaryReport，所有的运行都是Summary类型，Begin和End标记指出报告中包括的运行行数。Reps：告诉系统每一行重复运行的次数．点中Reps（重复次数）框，将第二行Reps改为2，则第二行会运行2次，这样总计三行的序列共运行四次。拖动下部滚动条将窗口移到右边位置。图46序列表SampleID：这一栏中的文字由在向导中输入的文字决定。将运行二的SampleID改为“TestMix002Twice”。Method：显示在向导中选择的方法。可以点击右边的绿色图标改变方法。Filename：显示在向导中输入的名称，文件名还显示日期和时间的象征符号＜D＞，因为日期和时间只有在序列运行的时候才知道。完成编辑后，选择File/Sequence/SaveAs将序列表保存并命名。RunningtheSequence运行这个序列在运行序列前，检查仪器的状态：检测器配置是否正确；灯是否点着；样品和缓冲液放置是否放置正确。必须在“online”状态下才能进行序列运行。在仪器窗口的工具条上点击绿色的双箭头打开以下对话拒。图47运行序列对话框点击打开图标选择刚刚建立的序列表。RunRange：允许选择只运行序列表的部分，在这一练习中选择“All”。Printing：允许系统在结束后自动打印报告。确认输入无误后点击Start运行序列表。系统运行时会检查方法的设置，如果有错误则会出现相应的信息，自动停止运行序列表。在改正错误后需要重新运行。经检查无误后，第一行的方法会传给P/ACEMDQ，然后开始运行。在运行过程中可以打开直接控制窗口查看仪器的实时状态。在每一次运行结束后，系统重新将方法传给P/ACEMDQ主机，然后开始新的运行。因此可以在运行过程中修改方法，下一次运行时将会采用经保存过的最新方法。同样也可修改序列表，但正在运行和已经运行过的行不能修改。序列运行结束后，产生四个文件，第二行的两个文件在名称后增加了“rep1”和“rep2”。第七章积分Description简介积分是为了正确计算峰面积，从而计算出待测组分的含量。其中的几个要点是峰的开始和结束，基线的形状和位置，如果峰未能完全分开，还需决定怎样分隔两峰的面积。下图是一张示例图。图48典型的色谱图在该例中两个组分完全分离，其他两个仅仅部分分离。四个峰的面积不一样，这表明四种组分的浓度不同，或是他们对检测器的响应不同。定量计算将在下一章中讨论，这一章将着重讨论峰的检测和基线的构造。IntegratingData积分数据峰的积分需要两个必需的参数：峰宽和峰阈。复杂的电泳图需要其他复杂的参数。在这一章中将用上一章中的testmix图谱进行积分计算。对于不同的检测器积分步骤都是相同的。配置一台UV检测器进行离机积分计算。在仪器窗口选择File/Method/New出现仪器设置窗口时将它关闭，在这一练习中不需进行设置。从仪器窗口选择File/Data/Open，找到示例文件Samplel.dat，在打开的仪器窗口选择通道A。按键Ctrl－Z使图像最大。辅助数据（电流、电压、功率、压力）不能积分。在电泳图上单击鼠标右键并选择Annotations(注释),出现以下对话框。图49图谱注释对话框对话框中选择的注解项目将在电泳图中显示。单台左面的Peak＃（峰号）、Area（面积）、andMigrationTime（迁移时间）和绿色的箭头将它们加入到右面。选中Baseline（基线）和ShowundetectedPeaks（显示未检测峰）。使对话框和上图一致点击OK（其中一些项目将在积分后才显示）。从方法案单选择积分事件（IntegrationEvents）。打开的数据表中有两个项目的默认值。Width（宽度）=0.2和Threshold（峰阀）＝50。可使用默认的参数进行最初的计算。从菜单条上选择Analysis/Analyze或点击分析按钮。积分过程需要几秒钟的时间，大的数据文件和多个的峰需要的时间会更多一些。在积分过程中分析按钮变为停止。点击停止后会放弃分析。积分结束后，大约有26个峰出现，在峰的上下会显示峰号、面积和迁移时间。默认的参数在确认主要的峰同时，也将基线漂移进行积分（可按住鼠标左键并拖动箭头将局部放大，按Ctrl－Z将图像缩小）。此外3.0到3.4分之间表示即使负峰也被检测。OptimizingIntegration优化积分选择Window/TileHorizontally，电泳图和积分参数表将并列排在一起显示。将电泳图调节到最小化，进入积分参数表，将Threshold调为100，重新分析。这次将会剩下10个峰。仔细察看14到15分钟的谱图会发现这些峰和真实的峰很相似。虽然这些峰是相当地小。峰阈值决定一个峰必须高于背景噪音后由积分软件被确认为是峰。增加峰阈值可过滤背景漂移。如果增加过多也会将真实的峰忽略不计。将峰阈值改为1000重新进行积分，主要的峰也不会被积分，峰的基线会发生巨大的改变。在尝试峰宽的效果时，将峰阈值改回100。点击分析，将主要的峰放大。再把峰宽改为0.l后分析。第二个峰的尾部被分为单独的面积，把峰宽改为0.5。分析后尾部也被分裂，但位置和前面有所不同。IntegrationParameters积分参数除了峰宽和峰阈值外还有其他的积分参数，在附录中有详细说明。在下个练习中我们将用其他一些参数进行复杂的积分计算。将峰宽改为0.2，峰阈值改为50。打开Sample2.dat，这是一张较为复杂的电泳图谱，先用系统默认的参数进行分析。会有很多的峰被积分，但末尾的大峰却未被积分。注意观察27到28分钟的图谱，有许多小峰，最后一个的峰号为150。由于软件最多能对进行150个峰积分，所以末尾的大峰被忽略了。我们对这150个峰并不是都感兴趣，因此需要对积分参数进行调整。Width峰宽先将图谱缩小；再将9.5分钟时的第一个主要的峰放大。该峰峰宽大约为0.5分钟，比周围的峰都要宽。在电泳图上单击鼠标右键，选择GraphicalProgramming，打开积分参数菜单。选择Width（峰宽），在状态栏上会出现提示：“Clickonthestartofthepeak”，将鼠标箭头移至第一个主要的峰起点点击左键，系统会提示在峰的终点再点击一次。在峰的起点和终点输入后，会出现以下的对话框，由于点击的地方不相同，所以你的值会有细微的差别。图50决定峰宽对话框中有许多有用的选项。Start和Stoptimes是你点击的两个点。Width的参数值就是两点的差。请注意InsertintoIntegrationEventstable和InsertintoManualIntegrationFixestable，这两者有很大的差别，选择前者，峰宽参数值会成为方法的一部分，会对任何以该方法积分的数据起作用；而后者则称为数据的一部分，仅对该数据目前分析起作用。在AddtoTable出按键后选，参数被加入积分事件表中，AnalyzeNow则会用新的参数进行积分。请选择AddtoTable。新的峰宽值会在积分事件表中出现，则一参数只会影响开始和结束时间间隔以内的积分，将新加入参数的开始和结束时间都设为0,则该参数值会对整张图谱有效。为了使你的积分结果和手册一致请将峰宽值设为0.5（你设定峰宽值应该和0.5非常接近）。由于在整个分析操作过程中，我们对同一参数使用了不同的值，因此需要将旧的参数删除,或采取另一种更为简便的方法：点击相应行左边的红色标记（√）,将标记去除，这一参数将会被忽略。您的积分事件表看起来应和下图一致。图51积分事件表Threshold峰阈值将图像缩小,点击分析。积分发生了很小的改变。依旧有许多小峰被积分。在电泳图上单击右键，选择GraphicalProgramming（色谱参数）/Threshold（峰阈值），按照状态栏的提示在起点（大约为0对分钟）和终点8.0分钟处单击鼠标。出现对话框时点击Analyze按钮,新的峰阈值大约为850时就会将0－8分钟的小峰过滤掉。和峰宽一样将峰阈值的开始和结束时间改为0,将值设为850,并将原有旧的阈值忽略后再进行分析。新的参数值把几乎所有的小峰过滤掉了，末尾的大峰也被积分，但对24－26分钟的积分仍旧有问题。将该区域放大，可以看到积分基线从峰开始的半峰高处开始。这说明整个图谱范围内采用一组参数并不会对每一个峰的积分都合适。我们需要对特殊的区域设置特定的积分参数。IntegratingaPeakCluster积分一组峰回想使用系统默认参数时，这一段的积分较为合理，或许其中一个参数或两者同时使用能得到满意的结果。将图像缩小，从GraphicalProgramming（色谱参数）菜单选择Width（峰宽），按照提示分别点击24和25分钟。这一次我们用图谱功能定义开始和结束时间，而不是峰宽。对话框出现后将峰宽值改为0.2，点击Analyze按钮。得到的结果和下图相仿。图52正确的积分应用两个峰宽参数：一个针对整个时间段。另一个针对某些（个）时间区域，得到的积分较为满意。IntegrationOff关闭积分将图谱缩小，积分基本完成，但未段的基线漂移依旧被认为是峰。将34分钟后的图像放大，可以看到35.2分钟后的峰不是我们所需要的。需要暂停积分时，从GraphicalProgramming菜单选择IntegrationOff，在图谱的35.8分钟处和结束时点击，然后分析。选择的区域内的积分被停止。所有的积分参数除了ShoulderSensitivity（峰阈值灵敏度）外都可用作全局或某一区域的参数。至此积分事件表的内容应该和下表相似。可能开始和结束时间会略有差别。图53积分事件表选择File/Method/Saveas将方法名称保存为IntegrationExercise.met（这一过程中会看到方法的分离时间为0.0的警告，选择Yes继续保存。这是由于该方法未对仪器进行设置，被软件的自动确认功能发现。在实际的操作过程中积分事件是加在用于采集数据的方法中）。IntegrationResultsandReports积分结果和报告积分的结果可以直接标注在电泳图上，也可从菜单条上选择Reports/View/Area%。打开系统的内置报告模板。如果有打印机连接便可按右键选择Print，打印出报告。第八章校准简介在早先的练习中介绍了用32Karat软件确定峰的参数，例如迁移时间、峰面积和峰高。这些信息用途有限，除非它能被转变成所描述的样品组分才可发挥作用。有两个基本的问题要问：“这个组分是什么？”和“在样品中含量有多少？”定性分析第一个问题“这个组分是什么？”属于定性分析。这可用2种不同的方法来回答。第一种方法；如果用一种已知的物质作为标准，则峰的迁移时间或迁移率（可能要结合其他的信息如二极管阵列的扫描吸收光谱），能作为未知样品的峰是否具有该标准物质的定性依据。第二种方法，如果迁移时间或迁移率根据一个分子的特性在一定的线性范围内变化；例如分子的质量或基本结构的数量，就能用一系列的标准物质建立一套标准的曲线，从而分析未知物的特性（如分子的质量）。在这个方法中；未知物不必有高纯度的标准物质。定量分析这练习将处理第二问题“在样品中含有多少？”这是属于定量分析。在定量分析中，我们用一种已知物质的不同浓度进行一系列的运行。确定在不同浓度下检测器的响应。根据检测器的响应所产生的曲线，来测定未知物质的浓度。32Karat软件简化了这项任务。它包含了一组工具，用此工具可收集标准物质运行所产生的数据，并绘制适当的曲线图，并且可应用曲线图的数据分析未知物质。这练习也将向你介绍利用样品表进行离机后的数据分析。我们将使用外标法进行校准；在这个方法中，标准物质和未知物质的数据分别在以前的运行中都已获得。创造一种校准方法在数据样品目录中包括了5个文件：Level1.dat、Level2.dat、Level3.dat、Level4.dat和Level5.dat。这些数据文件是由两种不同组分的五种不同浓度的运行结果，显示在下表中：Component(units/ml)FilenameAlphaBetaLevel1.dat1.04.0Level2.dat2.04.5Level3.dat3.05.0Level4.dat4.05.5Level5.dat5.06.0分析的第一步是确认两峰的出峰时间。打开仪器窗口（使用先前练习中的离机UV仪器）。选择File/Data/Open打开Level3.dat。当前的数据通道有两个：通道A（UV214nm）和通道C（电流）。最小化通道C，当它将不在这练习中被使用。通道A是中间浓度的电泳图。在3.5分钟和4.5分钟之间较小的峰是Alpha，较大的是Beta。创建一个校准方法我们将创建新的方法校准数据。选择File/Method/Open打开Calibrate.met。选择分析进行数据积分。（由于积分参数已经预先优化）两个峰会被很好的积分。在电泳图上点击右键，选择GraphicalProgramming，然后选择DefinePeaks。接提示在电泳图中点击一段区域（大约3.7和4.2分钟）。下列对话框将出现（你的时间值可能略微与显示的有些不同）：图54定义峰话框这个功能允许你把指定的时间窗口中的峰加入到Peaks/Groups表格中。但是仅仅在分析中被积分的峰才能被加入。开始和结束时间的定义范围是我们想要增加峰的电泳图的部分。Migrationtimewindow（迁移时间窗口）的定义是当峰的迁移时间变化超出范围后不再不是认为是该组分。可以设定为相对的百分比或是准确的时间间隔。我们能将窗口中所有的峰加到加到现有的表中。如果我们选择了Replaceexistingpeaks（更换现存的峰），在定义的时间窗口之内的任何已经被定义了的峰将被删除。在这个练习，使用默认值。从菜单菜中选择Method/Peaks/Groups，将打开一张表，其中列出已被增加上的2个峰。当这些峰还没被命名时，系统把迁移时间作为创建的一个名字。在Name列中把第一行命名为Alpha；第二行的名字为Beta。拖动窗口底部的滚动条查看表中的其它列。我们在这个练习中将仅仅使用这些列的一小部分。在附录1中能够得到更多的信息。在这里被改变的项目包括：1、定义组份的迁移时间和限定窗口。2、被使用的数据通道（如果有多通道的检测）。3、用于校准的曲线类型。4、最多10个校准水平。我们必须按上表的数据输入每一水平的浓度值。将表格滚动到右部直到看见列标题从Levell到Level5。输入Alpha和Beta的浓度值。Level1为最低浓度，level5为最高浓度。至此为止，对于其他列我们使用表中的默认值。当所有的数值输入后，表格应如图55。图55峰/组表保存你的方法。在电泳图谱上点击右键并且选择Annotations（注释）并将Name（名字）和ESTDconcentration（外标法浓度）参数选中。峰的名称将在电泳图谱上出现。由于还未进行校准ESTDconcentration故为0.000。我们已经用一个浓度的标样来定义我们的峰，然后要使用5个水平数据产生标准曲线。GeneratingtheCalibrationcurve产生校准曲线我们将通过序列表的重新运行产生标准曲线。在更早的练习中。我们使用样品表进行了多次的运行。样品表同样也能用于成批数据的重新处理。选择File/Sequence/New打开序列向导。点击文件图标并且选择Calibrate.met（我们已经编辑过的）。从DataFileType中选择existingdatafiles（现有文件）。点击Next打开允许选择多个数据文件的对话框。浏览数据文件夹找到Level1.dat,双击文件名将其加入到对话框底部的列表中。重复进行Level2、Level3、Level4和Level5，将5个文件加入到列表中。结束后点击Open。确认5个文件在窗口中列出，然后点击Finish。由此打开一张序列表格，包含方法和5个数据文件。移到右边Filename栏。5个文件应该按顶序列出。回到左边Level栏，将第一行从0改为1，将第二行改为2使序列表中的Level栏和Peak\Group表中Level栏相对应。继续把下面剩余的各栏分别改为3、4、5。当将level改为非零数值时,runtype会自动的变为Calibration。点击第一行RunType栏，出现如图56所示的对话框，列出运行的类型。选中ClearAllCalibration单台OK。该行的运行类型将改变为“CALCCA”。选择这种类型将在执行新的校准前把以前的校准数据清除。图56样品运用类型对话框将序列保存为Calibrate.seq。表的右边和左边应该看起来像图57。图57序列表现在准备运行序列并且产生标准曲线。从Sequence菜单选择Process。图58的对话框中将出现。Runrange为All，Processingmode（操作万式）为Reintegrate（在积分）。点击Start。整个过程仅需要几秒钟完成。当每个数据文件被分析后，在序列表格的status（状态）栏将变为“Complete”（完成）。图58重新运行序列对话框从菜单条选择Method/ReviewCalibration。一个窗口将打开，并且显示第一个组分（Alpha）的校准结果。数据看起来是合理的，在窗口的右上角选择Beta。Beta的曲线显然不可接受。窗口右下角显示拟合的类型为point-to-point。当然可以使用其它合适的拟合类型进行校准。重新打开Peaks/Groups表。移动到FitType栏。为第一行（Alpha）选择Quadratic（二次曲线）。为第2行（Beta）选择Linear（线性曲线）。在一行中，选中Zero栏，使曲线通过原点。不要在第二行中选中Zero。保存方法后再进行校准。这次拟会的曲线对Alpha和Beta都更好一些。在实际中，你需要选择不同的拟合类型得到最佳的曲线。通过保存方法把校准结果保存下来。不需重新运行序列。AnalyzingUnknowns分析未知物建立标准曲线后就可对未知物的含量进行计算。可以将未知物加入到标准序列的后面。当处理时，未知的峰将与标准曲线进行比较，计算出值。打开序列表窗口。在第6行中，点击Method栏选择Calibrate.met我们一直在使用这个方法。在Filename栏选择Unknownl.dat。保存序列，重新运行序列，在图58所示的对话框中选择Range，并输入6。点击Start。运行结束后打开Unknownl.dat的电泳图，也可从菜单栏选择Reports/View/ExternalStandard。在报告上点击右键可以使用系统默认的打印机打印报告。建立自定义报告将在以后的章节中讨论说明。本练习仅仅是最为基础的定量分析。更多的细节和选择参考在Appendixl。第九章定性分析DataAnalysisandReporting数据分析和报告在一些CE分离中，被测定物按照分子量大小的顺序分离出峰。例如：按照分子量的大小分离蛋白，按照碱基对的多少分离核酸。32Karatsoftware可以利用这样的一些参数作出标准曲线。以DNA分析为例，一个已知序列长度的片段进行凝胶电泳，可以用迁移时间对链长度作图，用于分析未知片段的长度。在这一练习中我们将利用标准DNA建立标准曲线。用ssDNA进行凝胶电泳，分离与分子量大小，小分子物质比大分子物质迁移更快。用已知长度的ssDNA标准系列的迁移时间作标准曲线，来计算未知片段的长度。图59标准DNA的电泳图以离机方式打开配置UV检测器的仪器，从数据实例目录打开ssDNA40-60.dat和Qualitate.met。这是长度从40到60的寡聚核甘酸的分离图谱，方法中已有积分和峰命名的参数。先分析数据，在图谱上单击鼠标右键，选择Annotations（注释），在要显示注释中增加名称。接着在方法中输入碱基数目（Y轴），及迁移时间（X轴）。从方法菜单选择“Qualitativeanalysis”（定性分析）打开如下对话框。图60质量分析对话框可以选择X轴的数据类型，练习中我们选择migrationtime（迁移时间），也可用其他参数如：Mobility（迁移率），X轴的刻度坐标可选直线或对数刻度。最小最大指拟合曲线X轴的数据范围。数据集合处理结束外，我们可推断出一个未知物的质量数。Y轴可以使用任何名字。因为我们的质量是指寡聚核苷酸的碱基对数目。输入Bases（碱基数），选择线性Y轴坐标适合我们的数据。在图60所示的对话框中显示两列，左边一列是Y轴，在此为Bases（碱基数）。右边一列是X轴，在此为migrationtime（迁移时间）。用直接输入法输入X和Y的数据值。要输入的数据值可以从某单选择Reports/View/Area%中看到，根据所见数据输入正确数据，在此输入碱基对数（从40-60）和迁移时间。当输入数据后，拟合的曲线图会在右下角显示。在数据全部输入后，选择拟合的类型为Cubic（三次曲线）。在此练习中良好的曲线是应用三次曲线获得的。在完成以后；将现方法更名为Qualitate1.met。再一次分析数据，在电泳图上单击鼠标右键，选择Annotations（注释）增加Quality，并将其小数位数设为2，点击OK。电泳图上会出现指定的质量数（作为名称）和通过拟会直线计算出的质量数。现在在电泳图上所显示的指定的碱基数（作为名字），并且该碱基数是用标准的曲线（作为质量）计算出的。这个碱基数是个整数；事实上，在所指定的值与由所选择完美拟合类型计算出的值之间的小差异不是完美无缺的。将样品的数据调出，应用此方法进行分析就可得出寡聚核苷酸未知片段的质量数。第十章使用迁移率迁移率是带电粒子在电场中的迁移能力。32KaratSoftware可以使用迁移率替代迁移时间定性，这样能避免由于每次运行时的细微变化所导致迁移时间的变化。MobilityMarkers迁移率参照物如果进行迁移率的计算，每次运行都需要迁移率参照物，参照物在一定的电泳条件下其迁移率是固定的。AssigningMobilityValues指定迁移率指定迁移率需要一系列的步骤。先假定分离方法已经建立，样品数据也已经过分析。l、运行一个包含迁移率参照物、EOF（电渗流）参照物和标准品，最好紧接着未知样品。电渗流参照物常用不带电的能在低浓度下被检测的小分子。用于计算电渗流和未知物的表现迁移率。如果分离条件下电渗流很小（例如用中性柱）则电渗流可以忽略以0计。2、进行积分计算，将迁移率参照物和电渗流参照物加入峰表中。从方法菜单打开AdvanceMethodsOptionsWindow的Capillary/Performance表格。将实际的数据按下图正确输入。3、在图谱的注释中选中ApparentMobility和Mobility并进行分析，这时的数据为“0”。4、按照下式计算电泳迁移率式中：ｕ为实际电泳迁移率ｕａｐｐ为迁移率参照物的表现迁移率ｕｅｏｆ为电渗流参照物的表现迁移率5、在峰表中移动到Mobility栏。输入对应迁移率参照物和电渗流参照物的迁移率。保存方法。6、重新分析样品，除了电渗流参照物外其它峰的迁移率不再为零。由于四舍五入的原因，电渗流参照物的迁移率为非常接近零的一个数字。7、下面可对方法进行编辑用过移率替代迁移时间。打开仪器窗口的初始参数表：图InstrumentSetup仪器设置图MobilityPlot（迁移率作图）选择迁移率或表现迁移率会在数据分析后增加一个附加的通道。该通道的X轴为迁移率（或表现迁移率）。“Plottraceaftervoltageramp”一般需要选中（打√），除非在电压上升过程中就有峰被检测。如果未选，则电压上升的时间会被计算在内。进行以上设置后保存方法，运