基于中医血瘀证研究的慢性乙型病毒性肝炎发病机制探讨

基于中医血瘀证研究的慢性乙型病毒性肝炎发病机制探讨

肝脏“主要储存血液”和“主要分散血液”的生理功能受刺激。病毒不容易清除，导致疾病的长期不全。血液抑郁症的形成通常是疾病发展的过程。关幼波、姜春华、王玉润等老中医都对此有相关的论述。瘀血是中医学中一个重要的概念,它既是致病因素,又是一种病理产物,“久病血瘀”、“久病入络为血瘀”。瘀血内阻引起血瘀证,其诊断研究随临床活血化瘀法的运用不断完善。血瘀证诊断标准的确立可谓血瘀证客观化研究的一个里程碑。全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会1986年修订了《血瘀证参考标准》,以后专家论证提示在诊断阳性率、敏感度、特异度、假阳性率、假阴性率和总和积分值等方面,中国血瘀证诊断标准最优。在临床与科研中的应用具有一定的广度和深度,但还须修订和完善。随着当代中医和中西医结合专家的重视,血瘀证的研究在规范化、客观化和计量化方面已取得不少成果。王阶教授等对血瘀证诊断若干方法学问题研究也使血瘀证诊断研究更趋客观化。中医学者对血瘀证深入科学研究为肝病血瘀证研究的实施提供了依据。虽然肝血瘀证的系统研究尚未开展,但慢性乙型病毒性肝炎(简称慢乙肝)病情进展三部曲的不同阶段均有瘀血存在得到各家的认同。“血瘀贯穿慢乙肝发展全过程”,“无瘀无肝硬化”,都对血瘀致病提出了相同的看法,并采用活血化瘀法进行治疗取得了较好的疗效。我们经过长期临床实践也发现肝血瘀证患者表现为明显的肝功能慢性损害,与纤维化指标、门静脉高压引起的改变密切相关,肝血瘀证不仅存在着全身血流动力学和血液流变学异常,肝脏局部的血液循环障碍也十分明显,肝血瘀证与病毒标志物密切相关。慢乙肝病情演变与瘀血存在着密切关系,且是一个动态的演化过程,在不同个体、不同病证、不同阶段,其组织病理学和病理生理学改变存在着量的差异甚至是质的差别。但从中医角度讲,都是肝内瘀血阻滞,是肝血瘀证的渐进过程。王永炎院士曾提出的证候要素和应证组合理论,对于证候规范化研究和辨证方法新体系的构建有着重要的指导意义。“证候”研究应首要继承的是“以象为素,以素为候,以候为证”理念。王阶教授证候要素和应证组合研究是对血瘀证的证候规范化研究的深化,朱文锋教授通过国家重点基础研究发展计划(973计划)提出辨证要素,简称“证素”的概念。证素不是指证候,但证素的确定,必须以病理表现为根据,即以症为据,从症辨证。证素的具体内容,主要包括病位和病性。由于肝血瘀证临床表现复杂,病理表达不一,还牵涉血流动力学或血液流变学改变以及代谢障碍。究其原因,首先是由于乙肝病毒诱导肝脏的慢性炎症反应,纤维化形成。其中TGF-β1、TNF-α等细胞因子作用于内皮细胞引起内皮素(ET-1)的合成与分泌,在炎症发生,纤维形成和发展中有重要的作用。与此同时血管内皮细胞和炎症细胞的炎症介质的刺激等,均可引起结缔组织代谢异常,导致肝硬化和肝癌的发生。以上部分作用环节在我们以往研究中已经得到证实。对于证本质的研究,以往研究表明证候的复杂性很难从微观的角度寻找诊断某一证候的实验指标,相关证的研究表明一个证有近百种实验指标发生变化,因此实验指标对于证候的诊断是弱特异性的。近年来人们分别从生化、生理、超微结构以及神经-内分泌-免疫网络等方面探讨证的实质,但都只反映了部分基因表达产物的改变,远未揭示证的实质,随着医学科学的发展人们意识到所有疾病都与基因相关,而基因的功能必须通过表达为蛋白质才得以实现。“证候基因组学”和“证候蛋白质组学”是从一个机体或一个组织、一个细胞等不同层次“整体”的基因或蛋白质活动的角度来揭示和阐明证候形成与发展的基本规律,这种研究思路与中医整体观不谋而合,具有明显的中医特色。但还不能完全揭示证的本质。而代谢组学是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的以定量描述生物体内代谢物多参数变化为目标的新兴“组学”,是系统生物学的组成部分。代谢组学应用液相色谱和质谱(LC-MS)、气相色谱和质谱(GC-MS)、以及核磁共振(nuclearmagneticresonanceNMR)等高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段,定性定量研究生物体体液中(包括血浆、尿液、组织液、细胞培养液等)的内源性代谢产物即代谢组,结合模式识别等化学信息学技术,分析生物体在不同状态下(比如生理与病理状态、给药前后等)的代谢指纹图谱的差异,获得相应的生物标志物群,从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态的一门学科。在代谢水平对细胞的分析,相对于常用的转录组学和蛋白组学分析有一系列的优势。该技术具有以下的特点:①基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大,从而使检测更容易;②代谢组学的研究不需建立全基因组测序及大量表达序列标签(EST)的数据库;③代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目(每个组织中大约为103数量级,即使在最小的细菌基因组中也有几千个基因);④研究中采用的技术更通用,这是因为给定的代谢物在每个组织中都是一样的缘故。在证候研究中有关代谢组学的相关研究较少,有基于核磁共振氢谱的组学分析方法研究气虚血瘀证大鼠和正常大鼠尿液的组成变化情况,研究发现病变大鼠尿液中甲酸、肌氨酸酐、α-酮戊二酸柠檬酸、牛磺酸、氧化三甲胺、琥珀酸、马尿酸等成分的含量发生了变化,为进一步揭示气虚血瘀证的产生机制和病症治疗提供了证据。另外,在大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究中从1HNMR图谱及模式识别分析发现:①正常组与模型组之间存在代谢产物谱的显著差异。说明血浆代谢组学分析能够较好地反映证候之间的差异,代谢组学技术是开展中医证候研究的好方法。②在1HNMR图谱中可以发现发生改变的代谢物可以作为肝郁脾虚证的生物标志物做进一步的研究。③内源性代谢物的改变提示动物能量代谢及脂肪、蛋白质代谢功能异常,这与已知的应激状态动物体内代谢的调节过程及结果相一致。分析这些内源性代谢产物的形成、转移机制和过程,可提示肝郁脾虚证的发生发展的潜在原因,从而揭示其生物学本质。有关肝血瘀证代谢组学研究方面尚无文献报道。以上研究表明代谢组学其核心思想是它能够通过整体代谢物图谱,直接认识生物体的生理和生化状态,代谢物组学通过研究“代谢指纹图谱”的变化,能更直接地反映体内生物化学过程和状态的变化。其研究对象主要是生物体液,如尿液、血液,主要研究手段是核磁共振。代谢组学强调把人体作为一个完整的系统来研究,通过测定人体各种体液内代谢物的组成变化来认识和反映人体代谢网络在疾病作用下的变化规律。这对于揭示复杂性疾病的机制的代谢模式具有独特的优势,与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常吻合,也与中医重视从人与自然、人与社会和人体内在的普遍联系和动态变化去分析、认识把握疾病发生、发展、变化的客观规律的认识一致。中医证候之间可能存在着非常明显的代谢产物的不同,这种不同是基于不同证候存在着不同物质代谢或其代谢网路的改变。中医证候的生物学基础可能用代谢组学技术来找出特异的标志性代谢产物,用生物信息学方法分析生物标志物的功能,并确定“中医证候相关代谢谱”。正如代谢组学之父、英国伦敦帝国理工学院JeremyNicholson教授认为,人体应该作为一个完整的系统来研究,应用代谢组学和全面性系统策略来理解疾病过程,与中医的整体观念和辨证论治思维方式不谋而合。动物模型是科学研究的一个重要手段,但是证候的诊断主要从宏观外在的表象进行,而对动物则难以用传统中医四诊收集这些外在表象,因此,复制证候的动物模型难度仍较大。在目前还不能建立可靠的,被大家公认的血瘀证动物模型的情况下,我觉得对证的客观化研究,研究对象还应该是人,但如何保持证的纯正是关键问题,毕竟在一个疾病的发展过程中往往会有一个或几个证的合并出现。在症候客观化研究中肝血瘀证的确定既要体现肝脏生理病理特性又要兼顾血瘀证本身的特点,同时还必须排除其他的间杂证来做相关研究才能更好体现肝血瘀证的本质,我们为了保证肝血瘀证的相对纯正性,在结合相关专家的研究的基础上采用加权减重法,即用于诊断的症状采用加权的方法,需要排除的症状采用减重的方法,将加权与减重得到的积分权重来判定血瘀证并区分轻重,通过初步临床应用,证实其可行性。总之,我们将基于中医整体观、系统观和辨证思维观,结合目前对于证的最新研究进展,通过积分系统确定相对纯正的肝血瘀证的基础上,结合代谢组学技术,采用LC-MS、GC-MS、NMR和分析联用技术,绘制血液代谢指纹图谱,借助于化学计量学等手段,将这些代谢信息与肝血瘀证的成分关联