金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

世界卫生组织（who）宣布，食物起源疾病和食品污染已成为世界公共卫生问题。每年发生的食源性疾病近数十亿例,发达国家每年至少有三分之一的人群患食源性疾病,其中约有170万15岁以下儿童因食源性微生物污染引起腹泻而死亡。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,简称金葡菌)是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。无论在发达国家还是在发展中国家,由金葡菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占有较大比例。该菌在自然界中分布广泛,在人体中主要存在于皮肤、粘膜,特别是鼻咽部,30%~80%的人群为该病原菌的携带者,因此金葡菌污染食品的几率较大。在美国,大约每年超过185000人发生金黄色葡萄球菌食物中毒,其中约1750人住院,每年损失约15亿美元;在欧盟,1993~1998年报告的金黄色葡萄球菌食物中毒共926起,占食源性疾病的4.5%。日本的调查结果表明,平均32.5%的食品存在金葡菌的污染。据美国CDC报告,金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌,居第2位,占细菌性食物中毒的33%。加拿大金葡萄的发生率更高,占细菌性食物中毒的45%,其引起的食物中毒也已成为世界性的公共卫生问题。近年来,我国每年由金葡菌引起的食物中毒事件已居第4位。鉴于此,采集7种食品样品,分离、鉴定其中污染的金黄色葡萄球菌,探讨该菌在食品中的污染状况,为预防由其引起的食源性疾病的暴发、流行及追踪污染源提供依据。1材料和方法1.1生鲜牛乳样品2006年7月到2007年7月共采集样品510份。除生鲜牛乳60份样品采自保定市市郊奶户外,其余450种样品均采自保定各超市及农贸市场。样品分类见表1。1.2pcr法测定电子天平高速冷冻离心机5417R,上海安亭科学仪器厂;电子恒温水浴锅HH.SY11-Ni,北京市光明医疗仪器厂;TGradientThermocycler96型PCR仪,德国Biometra公司;DYCp-32型电泳槽,北京市六一仪器厂;FA1004电子天平,上海天平仪器厂;DYY-8B型稳压稳流电泳仪,北京市六一仪器厂;BTS-20M型凝胶成像系统,德国UVITEC公司。1.3培养基胰酪胨大豆肉汤、7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、肉浸液肉汤、灭菌盐水、兔血浆均为本试验室自制。1.4标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC13565、ATCC25923均购自中国普通微生物菌种保藏中心。1.5分离和鉴定方法1.5.1金葡菌的分离和鉴定1.5.2uc基因验证由于一些非金葡菌菌株可能产生大量的活性很高的蛋白酶(假凝固酶),导致假阳性,所以采用PCR扩增耐热核酸酶(nuc)基因的方法对所获菌株进行验证。nuc基因为金黄色葡萄球菌DNA片断高度保守序列,该基因编码金黄色葡萄球菌耐热核酸酶,是金黄色葡萄球菌所特有的。引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR扩增程序:94℃预变性4min,94℃1min→58℃0.5min→72℃1.5min,30个循环,最后72℃延伸3.5min。2结果与分析2.1血平板的质量510份样品经增菌、分离培养、革兰氏染色镜检后得到疑似金黄色葡萄球菌的菌株,经血浆凝固酶试验和PCR扩增耐热核酸酶鉴定(见图1)后,108份样品被检出金葡菌。国标规定,金葡菌在血平板上生长菌落呈金黄色,有时为白色,菌落周围有溶血圈。但试验中发现大多数菌落在血平板上呈白色,仅个别呈金黄色,同时溶血圈的大小也有差异,且此差异仅出现在不同种类样品所分离的菌株中,这与不同菌株的溶血能力有关,但血平板的质量也是一个重要的因素。将同一批菌株接种于不同批次的血平板上,不同批次的血平板上出现的溶血圈有的差异明显,而有的血平板上的标准菌株观察不到溶血圈,表明血平板的质量对于此项鉴定很重要。试验中可用标准菌株划线于血平板作阳性对照,以防因血平板的质量问题而出现漏检。血浆凝固酶试验中,国标规定,如血浆呈现凝固,即将试管倾斜或倒置时呈现凝块者,被确认为阳性结果。其中呈现凝固没有定量的标准,试验中有些菌株凝固得牢固,而有些菌株的凝块具有大小不一的流动性。将出现半凝(不包括纤维状和絮状沉淀的凝固)的菌株提取基因组进行耐热核酸酶PCR扩增,结果发现只有1株半凝的菌株没有跑出特异性条带,而出现全凝的菌株有3株未出现特异性条带。可见,不能仅凭血浆凝固酶试验来鉴定金黄色葡萄球菌。2.2不同种类及微生物菌的检出情况对采集的7大类食品样品进行金葡菌的分离鉴定,结果见表3。金葡菌对7类样品均有污染,但其污染程度存在明显的差异。其中,生牛乳(38.3%)和速冻食品(34%)中该菌的检出率高于日本报道的平均值(32.5%);生肉及熟肉制品的总检出率高于生鲜肉;水产品、豆制品和果蔬的检出率较低,从而导致检出率的平均值低于报道值,这与所采集样品的种类、采集地点有很大的关系。2.3在不同的样品中，金色葡萄园的污染2.3.1生鲜乳中金葡菌的检测本试验中生牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率为38.3%。该菌在生牛乳中的检出率有国家及地区的差异,检出率在12%~79%之间不等。我国生牛乳中金葡菌的检出率在15%~38%[12~15]。Wilon等报道,世界上约有1%~2%的奶牛患有各种类型的乳腺炎,其中约有35%的奶牛患有亚临床型乳腺炎,金葡菌是引起乳腺炎的重要病原菌,而患有乳腺炎的奶牛是污染生鲜乳的主要原因。此外,生鲜乳挤出后,由于贮藏罐和环境等消毒不合格,也会造成生鲜乳的二次污染,这些原因共同导致了生鲜乳中金葡菌的高检出率。Terayama报道农户奶桶和农场奶罐中的污染率分别为65.9%和65.4%。国内曾有人采集了340份生鲜乳进行检测,奶牛个体和混装奶桶(罐)生鲜乳的污染率分别为39.0%和58.8%。因此,要减少金葡菌对牛乳的污染,除降低牛乳腺炎的患病率外,还应注意对贮藏罐和环境的消毒,避免二次污染的发生。2.3.2克氏原螯虾对高检出的影响生鲜肉中金黄色葡萄球菌的检出率为生鲜猪肉(50份)、生鲜牛肉(50份)、生鲜羊肉(50份)和生鲜鸡肉(50份)的平均值,其各自的检出率如图3所示。生肉中金黄色葡萄球菌主要来源于恒温动物(包括人类)及环境,在适合的条件下产生肠毒素。生肉制品在食物链中对食源性致病菌的传播起重要的作用,其中的金黄色葡萄球菌往往成为其它产品(如熟食等)污染的重要来源。本试验中将生肉分为4类进行检样,主要是考虑到各种生肉的销售环境相似,但不同种属动物生长及宰杀环境不同,宰杀后的带菌率也可能不同。从图3可以看出,生鸡肉的检出率明显高于其余3种生鲜肉。有报道称金葡菌在鸡舍环境中分布广泛,是一种很常见的条件性致病菌,存在于鸡的皮肤、羽毛、呼吸道以及肠道中,因此导致鸡肉的高检出率。说明不同种属、不同饲养环境对金葡菌的存在有一定影响。2.3.3金葡菌检验结果采集的肉制品包括生肉制品30份和熟肉制品20份。分别从10份生肉制品和5份熟肉制品中分离出了金葡菌,结果见表4。生肉制品(生肉包子馅)受金葡菌的污染状况远高于上述生鲜肉(21%)的污染状况。这些生肉馅均采自路边的包子铺,馅料的加工方式多为手工加工,再加上周围环境的污染,使金葡菌的检出率很高。20份熟肉制品中检出金葡萄的5份样品均采自卫生环境较差的集贸市场。2.3.4金葡菌污染的变化速冻食品:30份肉类(馄钝、水饺、肉丸类)速冻食品和20份非肉类速冻食品(汤圆、春卷、粽子等)。其中15份肉类速冻食品和2份汤圆中被检出金葡菌,见表5。据报道,冰棍中金葡菌可存活2年以上,在模拟冰淇淋中可存活7年之久,因此冷冻食品一旦被污染金黄色葡萄球菌,可长时间带菌,食用后诱发疾病。本试验中肉丸类速冻食品金葡萄的检出率高达75%。速冻食品受金葡菌污染的主要来源是加工用馅料,其原因可能是馅料加工过程中诸多环节的影响造成的。此外,肉馅本身容易染菌,导致肉类速冻食品的污染几率高于非肉类速冻食品。2.3.5水产品和水果中金葡菌的检出情况所检豆制品中,27份为即食型塑料袋装豆干类食品和红豆馅,23份为散装豆制品和绿豆饮料。其中,1份豆干类食品和1份绿豆饮料被检出金葡菌。水产品中4份样品被检出金葡萄,其中3份来自于大型超市,1份来自于集贸市场。金葡菌在水产品中的检出率不高,但其在卫生条件较差的集贸市场的检出率反而比超市的低,分析原因可能是由于集贸市场细菌多,一些杂菌的生长抑制了金葡菌的活性,导致检出率偏低。31份水果中5份样品被检出金葡菌,19份蔬菜样品中均未检出金葡萄。被检出金葡菌的水果采集于临街一水果摊,周围车辆、行人较多,可能是空气、灰尘及人手污染所致。2.4生鲜乳、生鲜食、猪肉的来源金葡萄在7类食品中的分布比例如图3所示。从图3可以看出,金葡菌主要来源于生鲜乳、生鲜肉、速冻食品和肉制品,其中生鲜肉所占比例最大,这与生鲜肉来自4种样品,样品基数(200份)大有关。其次为生鲜乳、速冻食品和肉制品。其中,肉类速冻食品的金葡萄污染高于其它速冻食品。3金葡菌污染食品。为了引起食品安全风险(1)金黄色葡萄球菌作为一种主要的食源性致病菌一直是医学界研究的重点。这是因为金葡菌在食品中分布的广泛性及对不良环境的抵抗能力在非芽孢菌中最强,能产生耐热的肠毒素,普通的烹饪条件无法使其失活。因此,在选购食品时建议选择知名品牌的合格商品,应在阴凉、通风、干燥、低温处贮藏食品,以防止金葡菌肠毒素的产生。(2)金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品:食品加工人员、炊事员或销售人员带菌,造成食品污染,有20%~30%葡萄球菌肠毒素食物中毒是由此引起的;加工前食品带菌或加工过程受到污染,产生肠毒素,引起食物中毒;熟食制品包装不严,运输过程受到污染。由此可见,金葡菌污染食品的机会很多。本试验中金葡菌的平均检出率21.2%,表明市售的各种食品中,此菌的污染情况不容忽视,应注意防止金葡菌引起的食物中毒。(3)由于人体表及呼吸道带菌,使加工的生肉制品更容易受到污染。本试验中肉制品的检出率(30%)明显高于生鲜肉的(21%)。其中生肉馅的金葡菌检出率最高达83.3%,从而证明了手工加工使食品污染金葡菌的几率加大。食品加工过