食品微生物：4 微生物分子进化与分类学

第4章

微生物的分类与鉴定contents1微生物分类的基本理论2细菌分类鉴定的特征和技术3微生物的快速鉴定和自动化分析1微生物分类的基本理论微生物分类学(microbialtaxonomy):研究微生物分类理论和技术方法的学科。从广义上讲，分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：分类、命名、鉴定1.1微生物分类学的三个组成部分分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定。

----根据现有数据建立系统的过程根据相互之间的相似性或进化亲缘关系将生物归属为类群或分类单元（taxa)。（美：沈萍与彭珍荣译，p428)1.1微生物分类学的三个组成部分命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称

----分类系统建立过程中的步骤之一命名是分类学的一个分支，给予分类类群单元与公布规则相符的名称。（美：沈萍与彭珍荣译，p428)]鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程.

--根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程。鉴定是分类学的实用方面，是决定某一特定分离物归属于某一已确认分类单元的过程。（美：沈萍与彭珍荣译，p428)]1.1微生物分类学的三个组成部分1.2分类单元及其等级分类单元（taxon,复数taxa)：

指具体的分类群（具有特定名称的分类群）。如：原核生物界(Procaryotae)、 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等

分类单元具有不同的水平和等级，国际公认的生物分类单元的7个分类等级自上向下为：界Kingdom

门DivisionorPhylum

纲Class

目Order

科Family

属Genus

种Species1.2分类单元及其等级 在分类中，若这些分类单元的等级不足以反映某 些分类单元之间的差异时也可以增加"亚等级"

即：亚界、亚门……亚种，在细菌分类中，还可 以在科(或亚科)和属之间增加族和亚族等级。1.2分类单元及其等级界Kingdom

门DivisionorPhylum

纲Class

目Order

科Family

属Genus

种Species值得强调的是，分类单元的等级只是分类单元水平的概括，它并不代表具体的分类单元。1.2分类单元及其等级分类等级分类单元中文名称英文名称拉丁名称学名词尾举例界KingdomRegnumProcaryotae(原核生物界）亚界SubkingdomSubregnum门DivisionDivisioGracilicutes（薄壁菌门）亚门SubdivisionSubdivisio纲ClassClassisScotobacteria(暗细菌纲）亚纲SubclassSubclassis目OrderOrdo-alesRickettsiales(立克次氏体目）亚目SuborderSubordo-ineae科FamilyFamilia-aceaeRickettsiaceae(立克次氏体科）亚科SubfamilySubfamilia-oideae（族）TribeTribus-eaeRickettsieae(立克次氏体族）（亚族）SubtrideSubtribus-inae属GenusGenusRickettsia(立克次氏体属）亚属SubgenusSubgenus种SpeciesSpeciesRickettsiaprowazekii(普氏立克次氏体）亚种SubspeciesSubspecies除此之外,在微生物分类中,还常使用一些非正式的类群术语,如：亚种以下常用培养物、菌株、种群和型；种以上常使用群、组、系等类群名称1.2分类单元及其等级根据CarlWoese的理论，现在还在界之上使用域(domain)把全部生物先分为:古生菌域真细菌域真核生物域域下面再分界1.2分类单元及其等级1.3常用的细菌分类学术语：

1）微生物种的定义

表型种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其他的菌株群有很明显的区别

基因型种：

基因组DNA杂交同源性在60-70%以上;或者16S rRNA序列同源性达97%以上的菌株定为一个种.2）菌株(strain)或病毒的毒株：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如诱变)所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。

菌株 是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。2）菌株(strain)或病毒的毒株：菌株强调的是遗传型纯；菌株与克隆（无性繁殖系）的概念相同；

同一菌种的不同菌株间，作为鉴定用的一些主要性状是相同的，非鉴定用性状上可存在很大的差异（如：产量性状）； 菌株实为一个物种内遗传多态性的客观反映，其数目是无限的；菌株实际上是某一菌株达到遗传型纯的标志，一旦变异，都应当标以新的菌株名称；菌株的名称可以随意确定；菌种保藏时，发表论文或生产等，都必须在菌种后标出该菌株的名称。2）菌株(strain)或病毒的毒株：例如：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)的2个菌株：BacillussubtilisAS1.398：蛋白酶生产菌BacillussubtilisBF7658：α-淀粉酶生产菌再如：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）的2个菌株EscherichiacoliK12：常用菌株EscherichiacoliO-157:H7：致病菌3）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。由单一微生物细胞繁殖产生的培养物，称为纯培养物。由多种微生物细胞繁殖产生的培养物，称为混合培养物。1.3常用的细菌分类学术语：••4）亚种(subspecies)或变种（variety):当种内不同菌株存在少数，但是明显而稳定的变异特征或者遗传性状，但是又不足以区分为新种时，就可以将这些菌株细分为更小的分类单元---亚种。 亚种是正式分类单元中地位最低的分类等级；

1976年后，细菌种的亚等级一律采用亚种，不再使用变种。1.3常用的细菌分类学术语：5）型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。例如：抗原特征的差异分为不同的血清型； 对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌体型等

菌株与型的区别菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据；不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名或鉴定不同的型必需有分类学依据。1.3常用的细菌分类学术语：5）型(form或type)：“Type”一词在分类中还有“模式或者典型”的意思，为避免误解，对型的表示词汇作了修改，用“-var”代替了“-type”表常用型的术语及其含义中文译名 生物型

血清型

致病型 噬菌型 形态型

推荐使用的名称biovarSerovarPathovarPhagovarMorphovar

以前使用的同义词biotypeSerotypePathotypephagotypelysotypephagotypelysotype应用于只有下列性状的菌株 特殊的生理生化性状

不同的抗原特征

对宿主致病性的差异 对噬菌体溶解反应的差异 特殊的形态学特征1.4微生物的命名生物名称区域性的俗名国际上统一使用的学名••其中种名:细菌的种名采用双名法命名.即：“属名+种名加词”，二元式组合属名在前，一般用拉丁字名词表示，首字母大写；种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写。如：Pseudomonasaeruginosa(铜绿色假单胞菌）Pseudomonas

是属名(假单胞菌属)；aeruginosa

是种名加词，是拉丁语形容词，原意为"铜绿色的"。••3)种名:细菌的种名采用双名法命名.

即：“属名+种名加词”，二元式组合

属名在前，一般用拉丁字名词表示，首字母大写； 种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写。 如：Pseudomonasaeruginosa(铜绿色假单胞菌）

Mycobacteriumtuberculosis（结核分支杆菌）

Bacillusthuringiensis（苏云金芽孢杆菌） 印刷体一般用斜体表示.在上下文中再次出现时，种名可缩写成：P.aeruginosa

亚种名

“属名+种名加词+subsp.亚种名加词”

Alcaligenesdenitrificanssubsp.Xylosoxylans

属名产碱杆菌属种名加词 反硝化的缩写

亚种名加词氧化木糖的该亚种名为：反硝化产碱杆菌氧化木糖亚种

Bacillussubtilissubsp.nigar

枯草芽孢杆菌黑色亚种命名法则

1)所有正式分类单元的学名,必须用拉丁词或拉丁化的词命名.2)属名:字首字母大写3)种名:二元式组合“属名+种名加词”4)亚种名:三元式组合“属名+种名加词+subsp.亚种名加词”5)属级以上分类单元的名称:特定的词尾6)属名,种名,亚种名印刷体一律斜体.

Bacillussubtilissubsp.nigar

枯草芽孢杆菌黑色亚种1.5细菌分类系统最理想的分类系统是:自然分类（naturalclassifica-tion)，即将那些具有许多共同特征的成员分为一个类群，并能够尽可能地反映生物的本性。

有两种方法建立分类系统

表型系统根据整个相似性将生物组织在一起；

系统发育系统根据可能的进化关系将生物组织在一起。1.5细菌分类系统1.表型分类系统：根据整个相似性将生物组织在一起；其特点：1.能够显示可能的进化关系；2.不是依赖于系统发育的分析；3.所有的表型特征同等对待，不考虑系统发育上主次作用；因此，最好的表型分类就是比较尽可能多的性状而建立起来的分类。1.5细菌分类系统2.系统发育分类：建立在进化关系上而不是普遍的相似性基础上。由于缺少好的化石记录，对于原核生物多是直接比较遗传物质和基因产物如：DNA、RNA和蛋白质等。1.5细菌分类系统----Bergey’sManual

Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology

《伯杰氏鉴定细菌学手册》1923年宾夕法尼亚大学的细菌学教授DavidBergy和四个同事发表了细菌分类法,至1994年,发行了第9版。各版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。从1974年的第8版开始,已经成为世界通用的“官方的分类”。(如1974年第8版，撰稿人多达130多位，涉及15个国家；现行版本撰稿人多达300多人，涉及近20个国家)。

美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1.5细菌分类系统----Bergey’sManual

（20世纪80年代）

Bergey’sManualofSystematicBacteriology

《伯杰氏系统细菌学手册》1984-1989年分4卷出版第一版（给出的系统基本上是表型性的），目前正在分5卷出版该手册的第二版（rRNA,DNA和蛋白质，系统发育）。伯杰氏系统细菌学手册第一版分类大纲——p339伯杰氏系统细菌学手册第二版分类大纲——p340从1984年第一版开始发行以来，细菌分类已取得了巨大进展，新命名的种成倍增加、新描述的属也在170个以上，尤其是80年代末以来，rRNA、DNA、蛋白质序列分析方法日趋实用，为细菌的系统发育积累了不少新的资料。伯杰氏系统细菌学手册第二版中更多地采用了核酸序列资料对分类群进行新的调整，无疑这是细菌系统发育分类的重大进展伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。1.5细菌分类系统----Bergey’sManual2细菌分类鉴定的特征和技术传统技术：形态学特征、

生理学特征、 生态学特征 血清型与噬菌体分型2.1形态学特征(1)培养特征:最重要是菌落特征：如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等.(2)细胞形态:形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)大小(其中最重要的是细胞的宽度或直径)排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)(3)特殊的细胞结构:鞭毛(有无鞭毛、着生位置及其数量);芽孢(有无芽孢、形状、着生位置、孢囊是否膨大)；孢子(孢子形状、着生位置、数量及排列);其他(荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连锁体等);超微结构(细胞壁、细胞内膜系统、放线菌孢子表面特征等)(4)细胞内含物:异染颗粒、聚β-羟丁酸等类脂颗粒、硫粒、气泡、伴孢晶体等(5)染色反应:革兰氏染色、抗酸性染色(6)运动性:鞭毛泳动、滑行、螺旋体运动方式2.2生理生化特征(1)营养类型:光能自养/异养、化能自养/异养及兼性营养型(2)氮源的利用能力:对蛋白质/胨、氨基酸、含氮无机盐、N2等的利用(3)碳源的利用能力:对各种单/双/多糖以及醇类、有机酸等的利用(4)对生长因子的需要:对特殊维生素、氨基酸等的依赖性(5)需氧性:好氧、微好氧、厌氧及兼性厌氧(6)对温度的适应性:最适、最低及最高生长温度及致死温度(7)对pH的适应性:在一定pH条件下的生长能力及生长的pH范围(8)对渗透压的适应性:对盐浓度的耐受性或嗜盐性(9)对抗生素及抑菌剂的敏感性:对抗生素、氰化钾(钠)、胆汁、弧菌抑制剂或某些染料的敏感性(10)代谢产物:各种特征性代射产物(11)与宿主的关系:共生、寄生、致病性等形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标2.3血清型和噬菌体型1、血清学试验： 例如： 根据鞭毛抗原(H抗原):苏云金芽孢杆菌分成40多个血清 型； 根据荚膜抗原:肺炎链球菌分成近百个血清型；根据菌体(O)抗原、H抗原和表面(Vi)抗原:将沙门氏菌属细菌分成约2000个血清型等等。血清型的划分在流行病的研究中有重要意义。

2、噬菌体型：噬菌体应用于细菌分类鉴定工作中的分型基础是：噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性，即一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株。但也存在宿主范围较广泛的噬菌体，是否反映属种间的系统发育相关性及其相关程度，目前尚没有明确的解析。2.3血清型和噬菌体型噬菌体分型Salmonellatyphi伤寒沙门氏菌现代技术：氨基酸顺序和蛋白质分析核酸的碱基组成和分子杂交rRNA的序列分析2细菌分类鉴定的特征和技术化学分类特征2.4氨基酸顺序和蛋白质分析依据：（1）蛋白质氨基酸序列的进化速率基本恒定。具有重要功能的蛋白质分子或蛋白质分子中的重要功能区域的氨基酸进变化速率低。（2）同功能蛋白氨基酸序列相似性越高，其亲缘关系越近。常用于分类鉴定的蛋白分子靶点：（1）细胞色素和电子传递蛋白（2）组蛋白（3）热休克蛋白（4）转录和翻译蛋白等通过氨基酸顺序判断细菌间的亲缘关系金枪鱼2.5核酸的碱基组成和分子杂交1）每个物种都有特定的GCmol%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GCmol%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。否定原则资料表明：（1）同一个种内的不同菌株GC含量差别在4--5%以下。否定原则：若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其GC含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，即将GC含量差别大于常规值的菌株进行排除的原则。资料表明：（2）同属不同种的差别应低于10--15%。否定原则：被鉴定的菌株GC含量差别大于15%，则肯定不是同一个属。2.5核酸的碱基组成和分子杂交

2.核酸的分子杂交：

不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间

亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之

间的亲缘关系就越近，反之亦然。

t直接分析比较DNA的碱基排列顺序

---由于技术上的