基因工程-5章文库目的基因克隆

第五章

基因文库的构建与目的基因的克隆第一节基因文库的构建GeneticEngineering一、什么是基因文库基因文库（genelibrary）：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因可以存在于长期保存的稳定的重组体中,需要时能够随时应用它分离目的基因.这种保存基因组遗传信息的材料称为基因文库（人工构建）。建立基因文库的目的:

便于目的基因的保存、扩增和纯化；是分离克隆目的基因的主要途径；是复杂基因组作图的重要依据。根据基因类型，基因文库分为：基因组文库(含有全部基因)cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因)基因组文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中，所有的抗性克隆组成了DNA片段的集合体，称为基因组文库。cDNA文库：某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。GeneticEngineering二、基因文库构建的基本战略:用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等.显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库GeneticEngineering①重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力②载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆③克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序④克隆片段易于从载体分子上完整卸下⑤重组克隆能稳定保存、扩增、筛选理想的基因文库应具备下列条件：GeneticEngineering三、

基因组文库构建将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中，所有的抗性克隆组成了DNA片段的集合体，称为基因组文库。1.构建基因组文库的载体②目前常用的载体载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少。①对载体的要求

载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kbGeneticEngineering断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备2.基因组文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：GeneticEngineering（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。GeneticEngineering各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾GeneticEngineeringGeneticEngineering3.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含整个基因组DNA的概率（99%）f:克隆片段的平均大小/生物基因组的大小N：基因组文库最低所含克隆数GeneticEngineering例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1054.61×GeneticEngineering二、cDNA文库的构建1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA2.cDNAlibrarymRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物将某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，克隆到细菌细胞中，称cDNA文库。GeneticEngineering（1）不含内含子序列（2）可以在细菌中直接表达（3）包含了所有编码蛋白质的基因（4）比DNA文库小的多，容易构建3.cDNA文库的特点4.构建cDNA文库的载体绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒.GeneticEngineering5.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）或者自己配制相关的试剂。利用mRNA含有的一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%（2）mRNA的分离纯化①原理GeneticEngineering采用用商业化的OligodT纤维柱②mRNA的分离纯化Column（柱）当总RNA通过已用oligo(dT)处理过的纤维素柱时，mRNA分子的poly(A)尾巴便会同oligo(dT)序列杂交而黏附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子则流出柱子。GeneticEngineeringGeneticEngineering反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以mRNA为模板合成cDNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物GeneticEngineering用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱GeneticEngineering剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链cDNA.。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成GeneticEngineering④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’GeneticEngineeringGeneticEngineering这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNA连接酶将冈崎片断连成一整条DNA链mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligaseGeneticEngineering在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶GeneticEngineering（5）导入受体细胞GeneticEngineering6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：文库最低所含克隆数1n1n第二节目的基因的克隆GeneticEngineering“克隆”（clone）

个体水平上，表示由具有相同基因型的同一物种的两个个体或数个个体组成的群体；细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体；分子水平上，凡带有一段DNA插入序列的、独特的寄主/载体单元亦叫做克隆。外源基因与目的基因：把插入到载体内的哪个特定的片段基因称为“外源基因”。将那些已被分离或者准备要被分离、改造扩增或表达的特定基因DNA片段称为“目的基因”。“鸟枪法”的概念直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又称为“散弹枪法”。是将基因组按染色体分开后，将其全部打乱，切成碎片，进行随机测定每个小片段序列，测序后利用计算机对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。一、鸟枪法克隆目的基因GeneticEngineering一、鸟枪法克隆目的基因基本战略：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。GeneticEngineering操作程序（1）目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。GeneticEngineering（2）与载体连接一般选择质粒或λ-DNA作为克隆载体（3）转化受体细胞多采用大