任务6单元1 抗原抗体的制备

任务六抗原抗体的制备主要内容单元一抗原的制备单元二抗血清的制备单元三单克隆抗体的制备单元四基因工程抗体学习目标1.掌握抗血清的制备过程及鉴定方法，正确判定抗血清的质量，能正确处理抗血清制备中的干扰因素。2.掌握单克隆抗体技术的原理、制备流程和应用。3.正确理解多克隆抗体、单克隆抗体和佐剂的概念。4.知晓免疫原的制备方法及意义。5.了解基因工程抗体的优点、种类和应用。单元一抗原的制备抗原（免疫原）：免疫原（immunogen)指用于制备抗体的抗原(antigen)或半抗原(hapten）。抗原颗粒性抗原可溶性抗原蛋白质抗原多糖抗原核酸抗原一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原细胞性抗原：血细胞和组织细胞病原体：细菌、病毒、支原体、寄生虫等采集静脉血玻璃珠脱纤维离心、洗涤调合适浓度（一）绵羊红细胞的制备(二)细菌抗原的制备用途:(1)作为诊断菌液。(2)用于制备免疫血清或诊断血清。1.制备方法培养细菌分离、鉴定扩大培养合适浓度灭活处理离心、洗涤2.细菌抗原的检定1.一般性状检定菌种典型；抗原为乳白色悬液；盐水中不自凝。2.无菌试验甲醛处理后37℃培养2-3d无菌生长3.纯度检查革兰氏染色镜检10个视野无杂菌。4.特异性试验玻片凝集试验强阳性。5.定量凝集试验凝集效价不低于原血清凝集效价的50%6.浓度测定。二、可溶性抗原的制备组织细胞粗抗原制备----组织、细胞清洗和去污处理细胞裂解（捣碎方法）匀浆物提取（初筛物）可溶性抗原制备----匀浆物中目的抗原提取纯化

（不同纯化方法，多次纯化）鉴定（定性、定量、特异性、理化性等）分装、保存可溶性抗原制备的一般流程二、可溶性抗原的制备（一）材料的选取与预处理（二）细胞裂解（三）纯化抗原的提取（四）抗原的鉴定（五）抗原的浓缩与保存五步骤（一）材料的选取与预处理组织：新鲜或低温保存（-40℃）处理方法：（1）器官或组织剪去包膜、结缔组织及大血管，生理盐水或缓冲液洗去残留血液和污物，剪成小块，再捣碎。（2）细胞缓冲液混悬后离心，再进行裂解或捣碎。二、细胞裂解1.细胞匀浆（1）高速组织匀浆器法（2）研磨法：玻璃匀浆器2.超声波破碎法适用范围：组织细胞和微生物细胞。机制：可能与强声波作用于溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关，空化现象引起的冲击波和剪刀力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度和细胞的类型。特别注意：使用时注意降温、防止过热，避免产生气泡。3.酶处理法适用范围：多种微生物细胞机制：利用酶反应，破会细胞壁上特殊的键，从而达到破坏细胞壁的目的。优缺点：优点：专一性强，酶解条件温和。

缺点：费用较高。应用做多的是：溶菌酶（专一分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4-糖苷键）。4.反复冻融法适用范围：培养细胞、细胞壁较脆弱的菌体机制：突然冷冻时细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。优缺点：优点：简便

缺点：①破碎率低②引起对冻融敏感的蛋白质变性5.表面活性剂处理法适用范围：

细菌和培养细胞机制：适当条件下（温度、pH、低离子强度），表面离子活性剂与脂蛋白形成微泡，使细胞膜通透性改变。优点：作用温和最常用的是：SDS，Tween（三）可溶性抗原纯化

1.蛋白质抗原的纯化纯化方法：

（1）超速离心法分离亚细胞成分和大分子蛋白质（2）选择性沉淀法盐析法最为经典（3）凝胶过滤法（4）离子交换层析法（5）亲和层析法（1）超速离心法原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。（2）选择性沉淀法原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸铵。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。（3）凝胶过滤法原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。（4）离子交换层析法原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。（5）亲和层析法原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高